基于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的新型冠狀病毒的不同標(biāo)本類型核酸檢測(cè)

周剛 李超 鄭國(guó)棟 柳洪濤 周榮榮 王洪濤 王剛平

新型冠狀病毒（Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus-2，SARS-CoV-2）感染正席卷全球多個(gè)國(guó)家爆發(fā)流行，感染人數(shù)不斷攀升［1］。截止到2020年3月26日，SARS-CoV-2 在我國(guó)確診人數(shù)已超過8 萬余人，全球其他國(guó)家感染人數(shù)已達(dá)37 萬余人并不斷持續(xù)上升，對(duì)全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了巨大威脅［2］。SARS-CoV-2 的傳染源有SARS-CoV-2 感染患者及無癥狀感染者［3］，尤其是無癥狀感染者的存在可導(dǎo)致疑似感染者及密切接觸者數(shù)量大量增加，加速疫情的蔓延。新型冠狀病毒肺炎的診斷基于流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)，而病毒的核酸檢測(cè)可為其診斷提供直接證據(jù)［4-5］，促進(jìn)患者的隔離、治療和評(píng)估，同時(shí)還能為疫情防控中心及時(shí)切斷傳播途徑、有效控制傳染源提供指導(dǎo)，保障疫情的防控。根據(jù)新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版），可采用基因測(cè)序、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real-Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）對(duì)SARS-CoV-2 感染者進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)進(jìn)而確診患者，而RT-PCR技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低而在臨床上得到廣泛應(yīng)用［6］。本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法對(duì)疑似SARS-CoV-2 感染患者進(jìn)行了SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，及時(shí)對(duì)疑似患者進(jìn)行快速有效的診斷，為疫情防控提供支持與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2020年1月至2020年2月送至本中心的2 258例疑似SARS-CoV-2 感染患者標(biāo)本共3 284人份，其中，男性1380例（61.12%），女性878例（38.88%）；年齡范圍為6 個(gè)月～91 歲，平均年齡為（35.49±16.13）歲。將符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》疑似病例描述的疑似感染者標(biāo)本均納入本研究中，采樣失敗或者流行病學(xué)史不明確、臨床表現(xiàn)不符合者均剔除。

1.2 試劑和儀器

病毒核酸提取試劑盒、病毒核酸提取儀Smart 32、熒光定量RT-PCR 試劑均為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供；陽(yáng)性標(biāo)本復(fù)核試劑由上海伯杰醫(yī)療科技有限公司提供；PowerMicrobiome?RNA Isolation Kit 由德國(guó)Qiagen 公司提供，Applied Biosystems?QuantStudio?1＆3＆5（以下簡(jiǎn)稱Q5）實(shí)時(shí)定量PCR 儀由美國(guó)賽默飛世爾科技公司提供。

1.3 標(biāo)本前處理與病毒RNA 提取

提前將水浴箱預(yù)熱至56℃，在生物安全柜內(nèi)用75%乙醇對(duì)裝有標(biāo)本的密封袋進(jìn)行噴灑消毒，用吸水紙擦拭后放入浴鍋中的試管架上，標(biāo)本蓋擱置重物防止試管架浮動(dòng)。每隔10 min 將標(biāo)本輕輕搖勻1 次，滅活時(shí)間為45 min［7-8］。將滅活好的標(biāo)本從水浴鍋中取出，在生物安全柜內(nèi)對(duì)密封袋進(jìn)行消毒，打開密封袋后，即時(shí)用75%酒精消毒。

咽拭子/痰液：取出樣本后混勻，參照病毒核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入20 μL 蛋白酶K，吸取離心后的標(biāo)本懸液上清200 μL，加入到預(yù)混的深孔板，于生物安全柜靜置10 min 后，置于病毒核酸提取儀Smart 32 上提取病毒核酸。程序運(yùn)行結(jié)束后，吸取核酸轉(zhuǎn)置于1.5 mL 離心管，直接用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR。由于RNA 容易降解，短暫存放可置于-20℃冷凍，長(zhǎng)時(shí)間保存需置于-70℃或以下。

糞便標(biāo)本：將送檢標(biāo)本取黃豆粒大?。s0.25g）置于1.5 mL 離心管中，采用PowerMicrobiome?RNA Isolation Kit 糞便RNA 提取試劑盒提取糞便中的核酸，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 PCR 擴(kuò)增

采用新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 法）針對(duì)ORF1ab基因和核殼蛋白N基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用儀器為Q5 實(shí)時(shí)定量PCR儀，擴(kuò)增程序如下：50℃15 min；95℃15 min；94℃15 s；55℃45 s，45 個(gè)循環(huán)；結(jié)果判讀：如果檢測(cè)標(biāo)本在FAM 和VIC 通道無擴(kuò)增曲線或Ct 值＞40，且Cy5 通道有擴(kuò)增曲線，可判樣品未檢測(cè)到2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）RNA；如果檢測(cè)標(biāo)本在FAM 和VIC 通道Ct 值≤40，且有明顯的擴(kuò)增曲線，可判樣品為2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）陽(yáng)性；如果檢測(cè)標(biāo)本僅在FAM 或VIC 單一通道Ct 值≤40，另一通道無擴(kuò)增曲線，結(jié)果需復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果一致可判樣品為2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）陽(yáng)性，復(fù)檢均為陰性可判斷為未檢測(cè)到2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）RNA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疑似SARS-CoV-2 感染者檢測(cè)結(jié)果

共收集2 258例疑似SARS-CoV-2 感染者標(biāo)本3 284 人份，其中1 539例為單份樣本；824例為雙份標(biāo)本，921例為三份標(biāo)本；因921 人份樣本中只檢測(cè)出1 份陽(yáng)性，故不納入統(tǒng)計(jì)；將單一樣本類型與兩種樣本類型陽(yáng)性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），增加樣本類型可以提高陽(yáng)性檢出率3 284 人份樣本中共檢出陽(yáng)性樣本79 人份；其中包括男性疑似感染者13例，女性7例，性別陽(yáng)性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

此外，在對(duì)20例疑似感染者重新采樣復(fù)檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，有4例疑似感染者檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)三次陰陽(yáng)互轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，還有1例疑似感染者多次口咽拭子、鼻咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，而痰液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的現(xiàn)象。

2.2 不同樣本類型核酸檢測(cè)結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光PCR 方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，在四種樣本類型中，鼻咽拭子與痰液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而其他三種樣本類型與其它樣本類型檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中口咽拭子陽(yáng)性檢出率最低，鼻咽拭子、痰液標(biāo)本相對(duì)口咽拭子較高，而糞便標(biāo)本陽(yáng)性檢出率最高（本組糞便的樣本量較小）。詳見表2。

表1 疑似SARS-CoV-2 感染者核酸檢測(cè)結(jié)果及男女陽(yáng)性檢出率比較［n（%）］Table1 Nucleic acid detection results of SARS-CoV-2 suspected patients and the positive rate in Male and Female groups［n（%）］

表2 疑似SARS-CoV-2 感染者不同類型標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果比較［n（%）］Table2 Comparison of nucleic acid detection results of SARS-CoV-2 suspected patients［n（%）］

2.3 同一疑似感染者、同一時(shí)間不同標(biāo)本類型病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

303 人次同一時(shí)間同時(shí)取口咽拭子、鼻咽拭子及痰液標(biāo)本采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 的方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，3 種樣本類型中僅痰液標(biāo)本檢出1 人份陽(yáng)性，3 種標(biāo)本相比，陽(yáng)性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；4 人次同一時(shí)間同時(shí)取口咽拭子、鼻咽拭子及糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，未檢出陽(yáng)性樣本；280人次同一時(shí)間同時(shí)取口咽拭子和鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，兩者陽(yáng)性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；132 人次同一時(shí)間同時(shí)取鼻咽拭子和痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，兩者陽(yáng)性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見表3。

表3 同一疑似感染者、同一時(shí)間不同標(biāo)本類型核酸檢測(cè)結(jié)果［n（%）］Table3 SARS-CoV-2 nucleic acid detection results at the same time in the same suspected patient with different sample types［n（%）］

3 討論

目前，全球疫情仍處于嚴(yán)峻的形勢(shì)。且SARSCoV-2 感染尚未有特效治療方法，及早發(fā)現(xiàn)感染者仍為疫情防控的關(guān)鍵。病毒的核酸檢測(cè)可快速診斷SARS-CoV-2 感染，為臨床治療提供依據(jù)、為防控隔離提供指導(dǎo)，阻止疫情擴(kuò)散。

本研究針對(duì)疑似SARS-CoV-2 感染者的口咽拭子、鼻咽拭子、痰液標(biāo)本及糞便標(biāo)本的檢出陽(yáng)性檢出率與其他研究者陽(yáng)性檢出率差異比較大［9］，主要原因?yàn)橐咔榘l(fā)病地域不同，疫情與非疫情區(qū)；單一樣本類型與兩種樣本類型陽(yáng)性檢出率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，對(duì)高度可疑的病人，臨床有必要增加標(biāo)本類型，提高陽(yáng)性檢出率。此外，本研究中性別陽(yáng)性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該統(tǒng)計(jì)結(jié)果也與Rui Liu 等［9］的結(jié)果不一致，在國(guó)內(nèi)其他研究中也有報(bào)道重癥患者中男性多于女性［10］，這可能與本研究來自非疫情區(qū)，陽(yáng)性樣本數(shù)過少有關(guān)。

本研究還觀察到4例疑似感染者檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)三次陰陽(yáng)互轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，還有1例疑似感染者多次口咽拭子、鼻咽拭子核酸檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，而痰液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的現(xiàn)象。疫情爆發(fā)后，有研究針對(duì)SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)假陰性問題進(jìn)行過探討，造成假陰性的原因有很多，標(biāo)本采集、檢測(cè)方法、產(chǎn)品穩(wěn)定性等因素都可能影響檢測(cè)結(jié)果［11-12］；有報(bào)道稱拭子樣本采用目前現(xiàn)有的RT-PCR 試劑盒，陽(yáng)性檢出率預(yù)估值為30%～50%［13］。因此，在確診SARS-CoV-2 感染的過程中應(yīng)綜合分析疑似患者的流行病學(xué)史、臨床癥狀以及影像學(xué)證據(jù)，必要時(shí)多次、多樣本類型綜合檢測(cè)以避免假陰性結(jié)果。

目前SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)最常用的標(biāo)本類型為口/鼻咽拭子，有研究顯示口咽拭子陽(yáng)性檢出率最低，與本研究結(jié)論一致［14］。SARS-CoV-2 最早確認(rèn)的傳播途徑是飛沫傳播和接觸傳播，隨著對(duì)SARS-CoV-2 病毒的研究與核酸檢測(cè)的科技攻關(guān)，且有研究首次在確診病例糞便中檢測(cè)到了SARSCoV-2 病毒［15］，使得糞便標(biāo)本在臨床患者篩查中成為重要的樣本類型；本研究中糞便樣本取樣不多，大多數(shù)為初次/多次檢測(cè)陽(yáng)性者，故糞便樣本陽(yáng)性檢出率高達(dá)56.25%，與吳冰珊等［16］的研究結(jié)論一致。

臨床反饋及研究都顯示單一的咽拭子樣本進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)時(shí)陰時(shí)陽(yáng)的現(xiàn)象，或出現(xiàn)咽拭子多次檢測(cè)陰性而糞便核酸檢測(cè)陽(yáng)性的情況。因此，本研究對(duì)同一疑似感染者、同一時(shí)間不同標(biāo)本類型病毒核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示與王云等的結(jié)論一致［17］，多樣本類型的一致性可為臨床提供更清晰明確的指導(dǎo)。

目前，SARS-CoV-2 仍屬于未知病毒，人類對(duì)其在體內(nèi)的活動(dòng)過程尚未完全清晰掌握，仍需要更多的研究來支持與指導(dǎo)臨床工作。本研究提示多種標(biāo)本類型的聯(lián)合檢測(cè)可能提高檢出率，為防控切斷傳播途徑，尤其是無癥狀感染者的傳播提供更準(zhǔn)確的判斷。