MicroRNA-124靶向調(diào)控caveolin-1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞惡性行為的研究*

寇大慶 孫文平 綦霞

肝癌是全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，其病死率居于所有腫瘤的第3位［1］。探索肝癌相關(guān)侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)志物，可為肝癌的治療提供新的指導(dǎo)。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為21～25 個核苷酸的小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因的調(diào)控。miRNA與肝癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，miR-124在肝癌細(xì)胞系和肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)量低［2］，且過表達(dá)miR-124可抑制肝癌細(xì)胞的增殖［3］。caveolin-1是細(xì)胞膜內(nèi)陷小窩的結(jié)構(gòu)蛋白，在腫瘤細(xì)胞惡性增殖、分化、預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用［4-5］。因此，闡明由miRNA調(diào)控caveolin-1的水平繼而影響肝癌細(xì)胞惡性行為的分子生物學(xué)機(jī)制對肝癌臨床診療尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象 1）組織標(biāo)本：收集2012年8月至2014年7月收治于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的臨床肝癌患者標(biāo)本32例，術(shù)后半年進(jìn)行隨訪用于臨床5年預(yù)后分析。所用樣本在取樣前均與患者簽署了知情同意書。所取肝癌組織經(jīng)病理醫(yī)生證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌，癌旁組織取自距離腫瘤邊緣3 cm以上處；2）細(xì)胞株：肝癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97H、肝癌細(xì)胞低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MHCC97L 及人胚腎細(xì)胞株HEK 293T購自南京凱基生物有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、Trizol 試劑及LipofectamineTM2000 試劑盒（美國Invitrogen 公司）；caveolin-1 pEGFP-N2 vector、miR-124 mimic/inhibitor、sicaveolin-1（廣州銳博公司）；雙熒光素酶報告質(zhì)粒pmirGLO（吉瑪公司）；CCK8 試劑（南京凱基公司）；PVDF 膜（美國Pall 公司）；多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；ECL發(fā)光試劑盒及QuantiTect Reverse Transcription Kit（美國Thermal Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將肝癌細(xì)胞株置于含有10%體積的熱滅活胎牛血清、1%體積的青霉素（100μg/mL）、鏈霉素（100μg/mL），90%體積的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，用胰酶消化后，將2 mL、密度為1×105個/mL 細(xì)胞懸液接種到6 孔板，培養(yǎng)24 h后，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書介紹的方法進(jìn)行miR-124 inhibitor、miR-124 mimic、caveolin-1、sicaveolin-1等轉(zhuǎn)染，48 h后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 RNA 提取和Real-time PCR 用Trizol 法提取人肝癌組織及肝癌細(xì)胞株中總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系為20 μL，在25℃反應(yīng)5 min，在42℃反應(yīng)60 min，在70℃反應(yīng)5 min，將所提取RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ加樣體系，再對所得的DNA 進(jìn)行實(shí)時定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為25μL，分別在95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火，72℃延伸30 s，共40 個擴(kuò)增循環(huán)。采用2-△△CT計算miR-124和caveolin-1的相對表達(dá)量。

1.2.3 免疫印跡分析 提取總蛋白并測定濃度。煮沸變性的蛋白以每孔30μg的含量點(diǎn)樣，經(jīng)濃縮膠為6%、分離膠為12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF 膜上，新鮮配制封閉液（5%脫脂奶粉）在37℃封閉2 h。分別加一抗caveolin-1（1：1 000）、內(nèi)參GAPDH（1：2 500）4℃孵育過夜。以PBS洗膜3次，每次8 min。然后加二抗37℃孵育90 min，PBS 洗膜3次。避光配制發(fā)光液，將PVDF膜放置于LabWork 凝膠成像曝光室內(nèi)，吸去膜表面多余水分，均勻?qū)l(fā)光液淋于膜上后發(fā)光即可，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 為檢測miR-124與caveolin-1的靶向結(jié)合關(guān)系，設(shè)計與miR-124 相結(jié)合的caveolin-1的3'-UTR序列以及突變序列，并分別將其構(gòu)建到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO上（此過程由上海吉瑪公司合成）。取對數(shù)生長期的密度為5×104個HEK 293T 細(xì)胞接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 達(dá)到80%融合度后，向24 孔板中共同轉(zhuǎn)染caveolin-1、miR-124及對照miR-NC 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。使用雙熒光素酶檢測試劑盒（Promega）分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.2.5 CCK8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 為檢測不同肝癌細(xì)胞的體外增殖能力，取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞（1×103個/孔）接種于96 孔板，每孔添加100 μL 培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的濕潤環(huán)境下，分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h 后，向各孔內(nèi)加入11μL CCK8 反應(yīng)液。4 h 后，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測各實(shí)驗(yàn)孔吸光度。

1.2.6 平板克隆實(shí)驗(yàn) 收集肝癌細(xì)胞，并制備成單細(xì)胞懸液；將1×103個細(xì)胞接種于6孔板中，充分吹打成單細(xì)胞懸液。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，每隔3天更換一次培養(yǎng)基；取出后經(jīng)10%甲醛固定40 min后，滴加0.1%結(jié)晶紫染液室溫染色20 min，PBS清洗數(shù)次并拍照。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將肝癌細(xì)胞加入到有8 μm ECMatrix 凝膠涂層的transwell 小室的上層中。在transwell小室的下層中，加入含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后，取出transwell小室，用棉簽輕輕擦去上層未轉(zhuǎn)移細(xì)胞。以甲醇固定transwell小室下層的細(xì)胞，瑞氏-吉姆薩染色，在顯微鏡下觀察侵襲的肝癌細(xì)胞，并計算百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。每組數(shù)據(jù)來自至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)用表示。采用t檢驗(yàn)分析樣本之間的差異。配對t檢驗(yàn)用于肝癌和癌旁組織間數(shù)據(jù)的比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-124 和caveolin-1 在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR分析顯示，miR-124在癌組織中的相對表達(dá)量（7.72±1.05）明顯低于癌旁組織（14.03±1.39，t=4.546，P<0.00 1）；miR-124在MHCC97H細(xì)胞中的相對表達(dá)量（1.00）低于MHCC97L細(xì)胞的相對表達(dá)量（3.11±0.72，t=8.713，P=0.013）。而caveolin-1的表達(dá)呈相反的趨勢，qRT-PCR結(jié)果顯示，肝癌組織中caveolin-1水平（12.21±1.21）明顯高于癌旁組織（8.06±1.29，t=3.345，P<0.001）；MHCC97H細(xì)胞中caveolin-1水平（1.00）明顯高于MHCC97L細(xì)胞（0.38±0.09，t=16.46，P=0.004）。miR-124和caveolin-1的表達(dá)與32例肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性見表1。

2.2 caveolin-1與miR-124的關(guān)系

通過生物信息學(xué)分析，caveolin-1 可能是miR-124 的潛在靶標(biāo)。為了證實(shí)miR-124 能夠與caveolin-1的3'-UTR結(jié)合，本研究進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示，caveolin-1 與miR-124 存在靶向調(diào)控關(guān)系（t=18.62，P<0.001，圖1A）。特異性上調(diào)MHCC97H 細(xì) 胞 中miR-124 的 表 達(dá)，caveolin-1 的mRNA 和蛋白水平均表達(dá)下調(diào)（t=9.031，P=0.012，圖1B）；特異性下調(diào)MHCC97L細(xì)胞中miR-124水平，caveolin-1 在mRNA 和蛋白水平較對照組顯著上調(diào)（t=4.468，P=0.047，圖1C）。

表1 肝癌患者miR-124、caveolin-1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 caveolin-1與miR-124的關(guān)系

2.3 miR-124 通過靶向調(diào)控caveolin-1 介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲

CCK8 分析顯示，MHCC97H 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic，96 h后，與對照組（OD=1.54±0.12）相比該細(xì)胞的增殖能力被抑制（OD=1.0±0.09，NC mimicvs.miR-124 mimic，t=3.279，P=0.035）；MHCC97H細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic 和caveolin-1，96 h 后，與miR-124 mimic 組相比，該細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（OD=1.44±0.08，miR-124 mimicvs. miR-124 mimic+caveolin-1，t=3.436，P=0.040）。平板克隆實(shí)驗(yàn)也顯示出相同的趨勢（NC mimic 組克隆數(shù)：672±61；miR-124 mimic組克隆數(shù)：209±32；miR-124 mimic+caveolin-1 組克隆數(shù)：475±56）。Transwell 結(jié)果顯示，MHCC97H 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic 后，與對照組（侵襲細(xì)胞數(shù)：41±8）相比，該細(xì)胞的侵襲能力下降（侵襲細(xì)胞數(shù)：17±3），共轉(zhuǎn)染miR-124 mimic和caveolin-1后，MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)（侵襲細(xì)胞數(shù)：29±5）。

MHCC97L 細(xì)胞被轉(zhuǎn)入miR-124 inhibitor，96 h后，與對照組（OD=1.16±0.17）相比該細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（OD=1.63±0.18，NC inhibitorvs. miR-124 inhibitor，t=3.469，P=0.026）；MHCC97L細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor和siCaveolin-1，96 h后，該細(xì)胞的增殖及侵襲能力受到抑制（OD=1.23±0.16，miR-124 inhibitorvs. miR-124 inhibitor+sicaveolin-1，t=2.896，P=0.044）。平板克隆實(shí)驗(yàn)也顯示了相同的趨勢（NC inhibitor 組克隆數(shù)：249±33；miR-124 inhibitor 組克隆數(shù)：954±98；miR-124 inhibitor+sicaveolin-1 組克隆數(shù)：260±42）。Transwell 結(jié)果顯示，MHCC97L 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor后，與對照組（侵襲細(xì)胞數(shù)：35±6）相比，該細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)（侵襲細(xì)胞數(shù)：54±8），共轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor和sicaveolin-1后，MHCC97L細(xì)胞的侵襲能力下降（侵襲細(xì)胞數(shù)：33±5）。

2.4 miR-124 和caveolin-1 與臨床肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性

采用Kaplan-Meier 法分析miR-124、caveolin-1表達(dá)與臨床肝癌患者5年生存率的關(guān)系。結(jié)果顯示，肝癌患者中miR-124 低水平組的總生存期低于高水平組（χ2=11.85，P<0.001），miR-124 低水平組5年生存率為20%，高水平組5年生存率為81.81%。高水平caveolin-1肝癌患者5年生存率低于低水平caveolin-1肝癌患者（χ2=8.79，P=0.013），高水平caveolin-1組5年生存率為42.11%，低水平組5年生存率為76.92%。

3 討論

miRNA 是一類非編碼單鏈的RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。異常miR-7 通過靶向調(diào)控PI3K/Akt 通路，可抑制肝癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移過程［6］。miR-26a 能夠通過抑制血管生成而延緩肝癌惡性進(jìn)展［7］。上述研究均證實(shí)，調(diào)控性miRNA 在肝癌進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織和低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞中相比，miR-124在肝癌組織及高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，提示miR-124為一類可抑制肝癌惡性進(jìn)展的重要分子。caveolin-1是一種細(xì)胞表面的穴樣內(nèi)陷（caveolae）中的主要膜內(nèi)在蛋白，參與調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)吞以及腫瘤轉(zhuǎn)移等重要生物學(xué)過程［8］。本研究檢測了caveolin-1 水平，發(fā)現(xiàn)其相比于癌旁組織和低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞，在肝癌組織及高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞中呈較高水平。這個結(jié)果提示異常的miR-124 和caveolin-1 水平可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

miRNA 常常結(jié)合到靶基因的3'-UTR 區(qū)而抑制靶基因功能的發(fā)揮［2］。已有文獻(xiàn)證實(shí)miR-124 能夠通過調(diào)控BIRC3 表達(dá)介導(dǎo)肝癌進(jìn)展［9］。通過雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，miR-124通過靶向調(diào)控caveolin-1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞惡性行為的發(fā)生。特異性改變肝癌細(xì)胞中的miR-124水平，能夠顯著影響細(xì)胞中caveolin-1表達(dá)。miR-124參與到肝癌及乳腺癌的惡性生物學(xué)行為［9-10］。在本研究中，調(diào)控肝癌細(xì)胞中miR-124的水平，可顯著影響肝癌細(xì)胞惡性行為。當(dāng)共調(diào)控細(xì)胞中的miR-124 和caveolin-1 后，該細(xì)胞的增殖及侵襲能力同樣被調(diào)控。此外，又進(jìn)一步分析miR-124 及caveolin-1 是否可作為肝癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測分子。根據(jù)對臨床患者生存跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)miR-124 和caveolin-1 均可作為潛在的判斷肝癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。

綜上所述，miR-124可能通過靶向調(diào)控caveolin-1介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的惡性行為，本研究旨在為肝癌的診斷及治療監(jiān)測尋找潛在的靶標(biāo)。