響應(yīng)面法優(yōu)化紫葉李皮中總多酚的提取工藝及其抗炎活性

高劍，孫煥然，國洪賓，陳保華，周程艷

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002)

炎癥是機(jī)體抵抗有害刺激產(chǎn)生的防御性反應(yīng)，在炎癥過程中，一方面是以防御為主的天然的局部反應(yīng)，對機(jī)體是有利的，而另一方面，炎癥又是有潛在危害的，過度的炎癥反應(yīng)會對機(jī)體造成嚴(yán)重的炎性損傷，這種炎性損傷主要是由炎癥部位大量的活性氧、O2-、·OH的產(chǎn)生引起的氧化損傷，主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛及功能障礙.過度劇烈和不受控制的炎癥可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生多種疾病，如腫瘤、高血壓、糖尿病、老年性癡呆等，涵蓋多個系統(tǒng)器官，嚴(yán)重危害人類的健康[1-3].二甲苯致小鼠耳腫脹及蛋清致大鼠足趾腫脹模型是常用的急性炎癥模型，因此在本文研究中筆者采用了此二者模型.目前臨床上使用的抗炎藥物主要是非甾體抗炎藥及糖皮質(zhì)激素藥物，長期服用會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，對機(jī)體造成一定的損害.相比較而言，傳統(tǒng)中藥、天然產(chǎn)物藥具有多靶點作用，藥效良好，無成癮性，不良反應(yīng)少及資源豐富等優(yōu)勢，具有重要的開發(fā)利用價值.

植物總多酚是從植物中提取的一類含有多個活性酚羥基的生物活性物質(zhì)，是天然抗氧化劑，能有效清除有害的活性氧和自由基，具有抗炎、抗氧化、延緩衰老等多種生物活性[4-5].目前，隨著植物多酚的廣泛應(yīng)用，多酚類研究已經(jīng)成為熱點.紫葉李(PrunusCerasifera)為薔薇科李屬藥食兩用的植物，原產(chǎn)于中亞和中國新疆天山地區(qū)，在中國廣泛種植，其皮中含有大量的多酚和黃酮類化合物，亦含有萜類、苷類以及維生素等多種成分，具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等生物活性，有較大的開發(fā)價值[6-8].目前，根據(jù)最新文獻(xiàn)表明，紫葉李(PrunusCerasifera)皮中總多酚(PTP)的提取工藝和抗炎作用的研究在國內(nèi)外均不夠深入.響應(yīng)面分析法是利用相關(guān)的實驗方法，對影響因素進(jìn)行設(shè)計并通過實驗得到一定的數(shù)據(jù)，將所得實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析、回歸分析，來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，從而可實現(xiàn)設(shè)計實驗、回歸分析、預(yù)測優(yōu)化的功能，其設(shè)計模型種類包括Central Composite、Box-Behnken、D-optimal、均勻設(shè)計等，而其中Box-Behnken設(shè)計應(yīng)用更為廣泛，便捷，更利于設(shè)計和優(yōu)化提取工藝參數(shù)[9].因此，在本文中筆者選擇了Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行相關(guān)響應(yīng)面分析，優(yōu)化PTP的提取工藝，提取制備了PTP，并對其體內(nèi)抑制小鼠耳廓及大鼠足趾炎癥進(jìn)行了研究，為紫葉李的進(jìn)一步開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性昆明種小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g；SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，均購于北京維通利華生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002.

1.2 材料與試劑

紫葉李于2018年8月在河北省保定市河北大學(xué)校園采摘，經(jīng)河北大學(xué)周程艷副教授鑒定為薔薇科李屬植物紫葉李(Prunuscerasifera)的正品，并經(jīng)曬干后備用.標(biāo)本(A1201808001) 存放于河北大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)研究平臺.沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海金穗生物科技有限公司)、福林酚試劑(山東西亞化學(xué)股份有限公司)、復(fù)方金銀花顆粒由廣西凌云縣制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，無水碳酸鈉、無水乙醇、二甲苯、濃硫酸均購于天津市北辰方正試劑廠.

1.3 主要儀器

Synergy HT酶標(biāo)儀(Gene Company Limited),RE-5299 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市榮華儀器制造有限公司),SHD-Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司),LGJ-18冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司),H2518D型離心機(jī)(上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司).

1.4 方法

1.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

制備100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液.準(zhǔn)確量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，分別加入福林酚試劑0.5 mL，振搖1 min，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% 碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，加蒸餾水至刻度，室溫下避光放置2 h，750 nm 波長處測定吸光度[10]，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度A750nm(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=111.81x+0.068 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0.表明在 0.001～0.01 mg/mL 內(nèi)沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光度A750 nm線性關(guān)系較好.

1.4.2 PTP的提取及其含量測定

準(zhǔn)確稱取2 g紫葉李皮，按照一定的料液比加入乙醇溶液，并在一定的溫度和時間的條件下回流提取，提取液定容至100 mL.精密量取該溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容.準(zhǔn)確吸取該溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，然后按照“1.4.1”方法測定750 nm波長處的吸光度.計算總多酚得率，總多酚提取得率按下式計算：

總多酚得率(mg/g)=ρ×K×V/m,

式中：ρ為供試品溶液中總多酚的質(zhì)量濃度 (g/L)，V為提取液的體積 (mL)，K為稀釋倍數(shù)，m為提取所用紫葉李的質(zhì)量(g).

1.4.3 方法學(xué)考察

通過重復(fù)性實驗、精密度實驗和穩(wěn)定性實驗考察福林酚試劑法測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性.重復(fù)性實驗：精密量取6份標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL，然后按照“1.4.1”方法操作，測定750 nm波長處的吸光度，結(jié)果證明RSD=1.97%(n=6).精密度實驗：精密量取1份標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL，然后按照“1.4.1”方法操作，重復(fù)測定6次750 nm波長處的吸光度，結(jié)果證明RSD=0.74%(n=6).穩(wěn)定性實驗：精密量取1份標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL，然后按照“1.4.1”方法操作，測定750 nm波長處的吸光度，結(jié)果表明在90 min內(nèi)溶液的穩(wěn)定性良好，RSD=1.81%.

1.4.4 總多酚的純化

準(zhǔn)確移取一定量PTP粗提液，在pH 7.0條件下加入CaCl2，加入量為紫葉李皮質(zhì)量的1.5倍，離心分離，即得多酚鈣鹽沉淀.向多酚鈣鹽沉淀物中以料酸比1∶1.5(mg∶mL)加入3 mol/L硫酸溶液，攪拌，放置，使之溶解.將轉(zhuǎn)溶后得到的清液，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，多酚酸溶液與乙酸乙酯萃取比為1∶2(體積比)，進(jìn)一步純化多酚[11].旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空干燥即得PTP成品，備用.

1.4.5 單因素實驗

單因素實驗分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度、料液比對PTP得率的影響，每個實驗重復(fù)3次.乙醇體積分?jǐn)?shù)采用40%、50%、60%、70%、80%5個水平；提取時間采用0.5、1、1.5、2、2.5 h 5個水平，提取溫度采用50、60、70、80、90 ℃ 5個水平；料液比(g∶mL)采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 5個水平.

1.4.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)4個因素為自變量，以總多酚得率為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平實驗設(shè)計，實驗因素及水平見表1，數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件分析.

表1 響應(yīng)面實驗因素水平

1.4.7 總多酚提取物對蛋清致大鼠足腫脹的影響[12]

取健康SD大鼠40只，隨機(jī)分成4組，每組10只，即模型組(MG，等量生理鹽水)、復(fù)方金銀花顆粒組(CHGG，10 g/kg)、總多酚高劑量組(THPG，5 g/kg)、總多酚低劑量組(TLPG，2.5 g/kg)，每日灌胃1次，連續(xù)5 d.末次給藥1 h后，于各組大鼠左后足趾皮下注射體積分?jǐn)?shù)10%新鮮蛋清0.1 mL，用游標(biāo)卡尺分別測量致炎后大鼠0.5、1、2、4 h的左足趾厚度.計算腫脹度、腫脹抑制率[13].

足趾腫脹度(mm)=致炎后左足趾厚度-致炎前左足趾厚度，

足趾腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%.

1.4.8 總多酚提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響[14]

取健康昆明種小鼠40只，分組，給藥方法同“1.4.7”，末次給藥1 h后，于各組小鼠左耳廓均勻涂抹二甲苯0.05 mL致炎，右耳廓作對照.涂藥1 h后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下左、右耳，用直徑為6 mm打孔器分別于同一部位打下2耳片，精密稱重，計算腫脹度、腫脹抑制率.

耳腫脹度(mg)=左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量，

耳腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%.

1.4.9 統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù) Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計出的PTP提取方案進(jìn)行PTP相關(guān)提取工藝的確定，最后得出其最佳提取工藝.然后，進(jìn)行相關(guān)的工藝驗證實驗，并與預(yù)測值相比較，此部分實驗需要進(jìn)行3次重復(fù).

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚的含量測定結(jié)果

重復(fù)性實驗中吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.97%，表明該方法重復(fù)性良好.精密度實驗中吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.74%，表明儀器精密度良好.穩(wěn)定性實驗中吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.81%，表明總多酚溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，因此該方法可用于總多酚的含量測定.

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 單因素實驗結(jié)果

在提取溫度50 ℃，提取時間1.5 h，料液比1∶30條件下，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，PTP得率達(dá)到最大值，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加得率降低.在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50 ℃，料液比1∶30條件下，提取時間為1.5 h，PTP得率達(dá)到最大值，之后隨著提取時間的延長，PTP得率降低.在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間1.5 h，料液比1∶30條件下，提取溫度為50～80 ℃，PTP得率隨著溫度的升高而不斷增加，提取溫度80 ℃時，PTP得率最高.在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時間1.5 h，提取溫度50 ℃條件下，料液比為1∶15～1∶30時，隨著料液比值的增加，PTP得率不斷增加，在1∶30時達(dá)到最大值，之后得率迅速下降.具體測定結(jié)果見表2.

2.2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表2 不同因素對PTP得率的影響

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著.

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

響應(yīng)面圖與等高線圖可以直觀地反映各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響程度.響應(yīng)面坡度陡、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互作用顯著，反之則表示兩因素交互作用不顯著.上述提取PTP的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖1A，圖1B和圖2,由圖1A,圖1B可知每個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，存在最高點，即圖2等高線最小橢圓的中心點，說明響應(yīng)值(PTP的得率)在4個因子設(shè)計的范圍存在最大值.

圖1A 提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)(a)、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)(b)、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)(c)對PTP得率影響Fig.1A Response surface plots showing the effects of extraction time and volume fraction of ethanol(a)、extraction temperature and volume fraction of ethanol(b)、solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol(c)on extraction rate of PTP

圖1B 提取溫度和提取時間(d)、料液比和提取時間(e)、料液比和提取溫度(f)對PTP得率影響的響應(yīng)面Fig.1B Response surface plots showing the effects of extraction temperature and extraction time (d)、solid-liquid ratio and extraction time (e)、solid-liquid ratio and extraction temperature (f)on extraction rate of PTP

圖2b、c等高線近圓形，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比交互作用均不顯著.從圖2a、d可以看出，等高線均呈橢圓形，初步表明乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間、提取時間和提取溫度交互作用顯著，與方差分析結(jié)果吻合.由圖2e、f可知，等高線呈扁橢圓型趨勢，說明料液比和提取時間、料液比和提取溫度的交互作用極顯著.軸向料液比相對于提取時間、提取溫度等高線均密集，表明料液比對PTP得率的影響較大，與方差分析結(jié)果一致.

圖2 提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)(a)、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)(b)、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)(c)、提取溫度和提取時間(d)、料液比和提取時間(e)、料液比和提取溫度(f)對PTP得率影響的等高線Fig.2 Contour plots showing the effects of extraction time and volume fraction of ethanol (a)、extraction temperature and volume fraction of ethanol (b)、solid-liquid ratio and volume fraction of ethanol (c)、extraction temperature and extraction time (d)、solid-liquid ratio and extraction time (e)、solid-liquid ratio and extraction temperature (f)on extraction rate of PTP

2.2.4 最佳提取工藝確定與驗證結(jié)果

通過軟件分析確定總多酚的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)69.3%，提取時間1.515 h，提取溫度80.9 ℃，料液比1∶30.55，PTP得率的理論值為55.7 mg/g.考慮到實際情況，修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)69%，提取時間1.5 h，提取溫度81 ℃，料液比1∶31.在此條件下進(jìn)行3次平行驗證實驗，得到PTP得率平均為55.3 mg/g，實測值與理論值無顯著影響(P<0.05)，此結(jié)果說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化PTP得率的數(shù)值是真實可靠的.

2.3 PTP抗炎作用的結(jié)果與分析

a.空白組;b.模型組;c.復(fù)方金銀花顆粒組；d.總多酚高劑量組；e.總多酚低劑量組.圖3 大鼠足趾腫脹Fig.3 Swelling of rat toe

2.3.1 PTP對蛋清所致大鼠足趾腫脹的影響

根據(jù)上述檢測方法的結(jié)果顯示：BG大鼠足趾無腫脹，趾間關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)明顯；MG大鼠足趾有嚴(yán)重的腫脹，足底厚度明顯增大，趾間關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)不明顯；CHGG與THPG大鼠足趾腫脹程度明顯減輕，TLPG大鼠足趾腫脹程度有輕微改善.在給藥后0.5～2 h，THPG大鼠足趾腫脹程度與MG相比差異極顯著(P<0.01)，TLPG與MG相比差異顯著(P<0.05)，在4 h時THPG、TLPG與MG相比均無顯著性差異.THPG、TLPG均在用藥后2 h腫脹抑制率達(dá)最高，而后腫脹抑制率相對降低，THPG的抑制率明顯高于TLPG.由此可見，PTP對蛋清所致大鼠足趾腫脹有明顯的抑制作用.具體測定結(jié)果見圖3和表5.

表5 總多酚對蛋清致大鼠足趾腫脹度的影響(±s,n=10)

*P<0.05,**P<0.01.

2.3.2 PTP對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

根據(jù)上述檢測方法的結(jié)果顯示，BG耳廓微紅色，無腫脹現(xiàn)象，與之相比，MG耳廓有明顯的紅、腫現(xiàn)象，CHGG、THPG、TLPG耳廓腫脹程度較MG有明顯的減輕，但差異并不顯著.致炎后，炎癥的癥狀如水腫、組織增生、血管擴(kuò)張的發(fā)生會引起耳朵增重，檢測耳朵的質(zhì)量差，可作為評價抗炎藥物藥效的指標(biāo).THPG、TLPG的腫脹度與MG相比有極顯著差異(P<0.01)，對小鼠耳腫脹的抑制率分別為21.68%、10.56%.結(jié)果表明，PTP對二甲苯所致小鼠耳腫脹均有明顯的抑制作用，且抑制作用與劑量成正相關(guān).測定結(jié)果見圖4和表6.

a.空白組;b.模型組;c.復(fù)方金銀花顆粒組;d.總多酚高劑量組;e.總多酚低劑量組.圖4 小鼠耳廓腫脹Fig.4 Swelling of ear laps in mice

表6 總多酚對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

*P<0.05,**P<0.01.

3 討論

近年來，響應(yīng)面分析法在優(yōu)化黃酮、多糖、多酚等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用，與傳統(tǒng)的正交設(shè)計實驗相比，響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)分析更為詳細(xì)，不僅可以直觀看出各因素對提取物得率影響的顯著情況，還可以進(jìn)一步分析兩因素間存在的交互作用，借助軟件可以三維模擬出更直觀更精準(zhǔn)的最佳工藝，預(yù)測值準(zhǔn)確性較高[15].Song W等[6]測定紫葉李葉片中提取的PTP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(117.8±8.8)mg/g，枝條中提取的PTP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(100.04±1.9)mg/g；汪洪濤[16]等測得紫葉李果實中提取的PTP質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.13 mg/g.但是未見PTP的提取和活性的研究，因此本實驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化PTP的提取工藝，并得出最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)69%、提取時間1.5 h、提取溫度81 ℃、料液比1∶31 ，該工藝下PTP的得率為55.3 mg/g.與Song W[6]和汪洪濤等[15]的實驗研究相比，筆者發(fā)現(xiàn)紫葉李不同部位的PTP含量還是有一些差異的.同時紫葉李PTP的含量也會受成熟度、品種、環(huán)境條件、生長季節(jié)等的影響[17].

綜上所述，本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化的PTP提取工藝設(shè)計合理，可在連續(xù)范圍內(nèi)進(jìn)行分析，重現(xiàn)性好、提取得率較高,對其工業(yè)化生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義.PTP具有良好的抗炎作用，其作用機(jī)制可能與有效清除有害的活性氧和自由基等有關(guān).本實驗結(jié)果將為今后進(jìn)一步研究PTP抗炎活性的臨床應(yīng)用提供參考，為提高紫葉李樹綜合經(jīng)濟(jì)效益提供一定依據(jù).