釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化及微生物群落結(jié)構(gòu)的研究

張騰， 王世朋， 孫照勇， 王松濤， 沈才洪

(1.四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610065；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000)

中國(guó)是世界上主要的白酒生產(chǎn)國(guó)，白酒年產(chǎn)量約1 300萬(wàn)t[1]。釀酒廢糟是白酒生產(chǎn)過(guò)程中主要固體副產(chǎn)物，主要由發(fā)酵谷物如高粱、玉米、小麥、大麥、大米以及稻殼等組成[2-3]。據(jù)推算，2015年中國(guó)釀酒廢糟的年產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到約4 000 萬(wàn)t。釀酒廢糟的含水率較高，同時(shí)含有大量的易降解有機(jī)質(zhì)，處置不當(dāng)極易腐敗并產(chǎn)生臭氣，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。傳統(tǒng)的處理方法是將釀酒廢糟飼料化和焚燒，然而低蛋白和高纖維的特性使其動(dòng)物適口性差[4]，飼料化利用效率較低，難以推廣應(yīng)用；同時(shí)，較高的含水率使釀酒廢糟不易焚燒，導(dǎo)致后續(xù)運(yùn)行成本的增加以及二次污染的產(chǎn)生。因此，快速有效處理釀酒廢糟并實(shí)現(xiàn)其資源化成為釀酒企業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

厭氧消化是將有機(jī)質(zhì)通過(guò)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)換為沼氣，實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物的減量化、無(wú)害化和資源化[5]。由于釀酒廢糟中有機(jī)物固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了90%以上，因此可作為厭氧消化底物。相比于濕式厭氧消化(總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)<15%)，干式厭氧消化(總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)>15%)優(yōu)勢(shì)十分明顯，包括更小的反應(yīng)器體積、更少的水消耗、更少的能量投入和更少的消化殘?jiān)萚6-7]。近年來(lái)，干式厭氧消化工藝在工程上的應(yīng)用愈加廣泛。2010年歐洲約60%的反應(yīng)器采取干式厭氧消化工藝[8]。溫度是影響厭氧消化過(guò)程的重要因素之一。目前，大多數(shù)厭氧消化系統(tǒng)都在中溫(20～40 ℃)條件下運(yùn)行，同時(shí)對(duì)高溫(50～60 ℃)厭氧消化的研究也在不斷增加[9]。高溫可以更大程度削減病原體，縮短水力停留并提高沼氣產(chǎn)量[10]。另外，高溫可以促進(jìn)木質(zhì)纖維的降解，有利于處理木質(zhì)纖維素原料[11]。釀酒廢糟中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量較高，高溫下可能更有利于釀酒廢糟厭氧產(chǎn)沼氣。然而也有研究者認(rèn)為，高溫下有機(jī)物降解菌活性高導(dǎo)致產(chǎn)酸更快，容易造成揮發(fā)性有機(jī)酸的積累[12]。SUN等[13]以啤酒糟為底物進(jìn)行批次干式厭氧消化(固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%)試驗(yàn)，結(jié)果表明高溫條件下甲烷產(chǎn)氣率優(yōu)于中溫，最大甲烷產(chǎn)氣率為310.4、220.1 mL·g-1有機(jī)質(zhì)。SHI等[9]對(duì)比中溫和高溫玉米秸稈干式厭氧消化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)高溫干式厭氧消化在試驗(yàn)前期纖維素和半纖維素降解速率更快，但是高溫干式厭氧消化過(guò)程的揮發(fā)性有機(jī)酸積累量是中溫過(guò)程的5倍，這導(dǎo)致了高溫反應(yīng)器的pH值大幅度下降。厭氧消化是復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，其運(yùn)行表現(xiàn)與微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。LIU等[14]對(duì)比了不同溫度(35、38、41和44 ℃)下玉米秸稈厭氧消化過(guò)程中微生物群落變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，厚壁菌門(Firmicutes)逐漸取代擬桿菌門(Bacteroidetes)成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。GUO等[15]發(fā)現(xiàn)中溫厭氧消化系統(tǒng)中細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌的豐富度與均勻度都高于高溫系統(tǒng)。YU等[16]研究了生物廢物和污泥中高溫共消化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)中高溫反應(yīng)器中占主導(dǎo)地位的產(chǎn)甲烷菌同時(shí)包括甲烷桿菌(Methanobacterium)和甲烷八疊球菌(Methanosarcina)，但是在高溫反應(yīng)器中優(yōu)勢(shì)菌屬還包括甲烷熱桿菌(Methanothermobacter)。MOSET等[17]發(fā)現(xiàn)高溫厭氧消化系統(tǒng)較中溫系統(tǒng)具有更高有機(jī)物降解能力和甲烷產(chǎn)率，然而高溫系統(tǒng)的微生物多樣性較低，特別是細(xì)菌群落。目前，干式厭氧消化多是以餐廚垃圾和農(nóng)作物秸稈為主，以釀酒廢糟為底物的研究較少。本研究以釀酒廢糟為底物，探究中溫和高溫條件下的釀酒廢糟干式厭氧消化過(guò)程中的運(yùn)行表現(xiàn)，并比較2種溫度條件下微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，為釀酒廢糟的干式厭氧消化工藝選擇和優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

釀酒廢糟由四川瀘州某酒廠提供，經(jīng)粉碎機(jī)(MKCA6-2,日本Masuko Sangyo公司)粉碎至3～5 mm，于-20 ℃冷凍儲(chǔ)存。接種污泥取自本實(shí)驗(yàn)室處理市政污水處理廠脫水污泥的中溫(37 ℃)厭氧消化反應(yīng)器。釀酒廢糟和接種污泥理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

采用2 L玻璃反應(yīng)器(工作體積為1 L)，裝入接種污泥后分別放入中溫(37 ℃)、高溫(52 ℃)培養(yǎng)箱進(jìn)行餓養(yǎng)馴化7 d，按m(釀酒廢糟有機(jī)物)∶m(接種污泥有機(jī)物)=1∶1混合均勻，此時(shí)混合物總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，取樣并記為0 d樣品。為了保證有機(jī)質(zhì)充分降解，厭氧消化過(guò)程共持續(xù)70 d。反應(yīng)器用硅膠塞密封，產(chǎn)生的沼氣通過(guò)乳膠管導(dǎo)入到集氣槽(有效體積1.5 L)，通過(guò)集氣槽刻度記錄沼氣體積后將其排出，記錄頻次為45 d(快速產(chǎn)氣階段)之前3 d記錄1次，最后于70 d(產(chǎn)氣停滯階段)記錄1次。為降低頻繁打開(kāi)反應(yīng)器取樣對(duì)厭氧體系中微生物產(chǎn)生的人為影響，同時(shí)根據(jù)厭氧體系微生物動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[18]，厭氧消化污泥取樣頻次為45 d之前3～6 d取樣1次，最后于70 d取樣1次。樣品分別儲(chǔ)存于4和-80 ℃以用于理化性質(zhì)測(cè)定和微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

表1 釀酒廢糟和接種污泥理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of distilled grain waste and inoculated sludge

注：NM表示未檢測(cè)。

Note:NM means not measured.

1.3 模型建立及理論產(chǎn)沼氣體積計(jì)算

釀酒廢糟的厭氧消化產(chǎn)沼氣的累積體積通過(guò)修正的Gompertz模型進(jìn)行擬合，修正的Gompertz模型如下所示[18]。

y=Aexp{-exp[μme(λ-t)/A+1]}

(1)

式中：y為第t天物料累積沼氣產(chǎn)量；t為發(fā)酵時(shí)間；A為物料產(chǎn)沼氣潛力；μm為最大產(chǎn)氣速率；λ為遲滯時(shí)間；e為自然常數(shù)。

釀酒廢糟中的有機(jī)物可通過(guò)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)換為沼氣，有機(jī)物通常用分子式CaHbOcNd表示。因此，1 mol有機(jī)物CaHbOcNd的理論產(chǎn)沼氣體積(L)可由Buswell方程式(2)和公式(3)算出。

(2)

(3)

1.4 理化性質(zhì)測(cè)定

沼氣體積采用排水法測(cè)定[19]；總固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)(total solid, TS)：采用烘干法[20]，將樣品放在105 ℃烘箱(MOV-112(U)，日本三洋公司)烘干至恒重測(cè)定；有機(jī)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(volatile total solid, VTS)和灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(ash)：采用灼燒法[21]，將烘干至恒重的樣品放入馬弗爐(TMF-5T，日本托馬斯公司)后在600 ℃下灼燒2 h測(cè)定；pH值采用pH計(jì)測(cè)定(pHS-3C)；可溶性總有機(jī)碳(soluble total organic carbon, S-TOC)用總有機(jī)碳分析儀測(cè)定(TOC-VE，日本島津公司)；揮發(fā)性有機(jī)酸(volatile fatty acids, VFAs)用高效液相色譜測(cè)定(HPLC SCL-10Avp，日本島津公司)，包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸；碳、氫和氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)用元素分析儀測(cè)定(Vario EL，德國(guó)艾力蒙塔公司)，碳氮比由碳和氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值求出，氧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由單位質(zhì)量總固體減去碳、氫、氮和灰分的質(zhì)量后求出；銨根離子(NH4+)用離子色譜儀測(cè)定(ICS-1100，美國(guó)戴安公司)；木質(zhì)素、纖維素和半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)用范式法測(cè)定[22]。

1.5 DNA提取及分析

樣品微生物DNA采用CTAB法提取，DNA樣品經(jīng)過(guò)質(zhì)檢后送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。高通量測(cè)序用細(xì)菌和古菌通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和909R(5′CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′)擴(kuò)增16S rRNA的V3～V5可變區(qū)。

測(cè)序原始數(shù)據(jù)首先采用Prinseq軟件(PRINSEQ-lite0.19.5)進(jìn)行質(zhì)量控制，去掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)；并采用Flash軟件去除引物序列、短片段、低復(fù)雜度等序列；最后用Usearch軟件(V 8.0)檢測(cè)嵌合體序列，去除嵌合體序列后得到有效數(shù)據(jù)。所有樣品的全部有效序列利用Qiime軟件以97%的相似性將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，再利用RDP Classifier軟件(V 2.2)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行物種注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化運(yùn)行情況

2.1.1 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化累積產(chǎn)沼氣體積對(duì)比 根據(jù)前期記錄的產(chǎn)沼氣體積以及修正的Gompertz模型，釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程中累積產(chǎn)沼氣體積變化趨勢(shì)和擬合曲線如圖1所示。中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程的累積產(chǎn)沼氣體積相差不大，但產(chǎn)沼氣速率在不同時(shí)段存在著較大差異。中溫和高溫系統(tǒng)在發(fā)酵初期6 d產(chǎn)沼氣體積均較低，這可能是系統(tǒng)微生物對(duì)釀酒廢糟原料需要一定的適應(yīng)期。適應(yīng)后產(chǎn)氣速率快速增加，持續(xù)至40 d之后產(chǎn)氣體積趨于平穩(wěn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)2個(gè)系統(tǒng)的累積產(chǎn)沼氣體積分別為16.25、16.90 L。根據(jù)釀酒廢糟C、O、N和H元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，推算其分子式為C3.572H6.08O2.5N0.164，用Buswell方程式(2)和公式(3)計(jì)算釀酒廢物原料理論產(chǎn)沼氣體積為39.33 L。因此，中溫和高溫系統(tǒng)沼氣回收率分別為41.32%和42.97%。

利用Gompertz模型擬合得到的產(chǎn)沼氣潛力、最大產(chǎn)沼氣速率與遲滯時(shí)間的結(jié)果如表 2 所示。擬合得到中溫和高溫條件下釀酒廢糟產(chǎn)沼氣潛力分別為16.51、18.12 L，最大產(chǎn)沼氣速率分別為0.519、0.454 L·d-1，遲滯時(shí)間分別為1.11、6.12 d。高溫條件下釀酒廢糟產(chǎn)沼氣潛力高于中溫，但中溫條件下最大產(chǎn)沼氣速率較大，且遲滯時(shí)間短于高溫條件。

圖1 釀酒廢糟中高溫干式厭氧消化累積產(chǎn)沼氣體積和擬合曲線

表2 中溫和高溫累積產(chǎn)氣曲線模型擬合參數(shù)
Table 2 Parameters of cumulative biogas yield fittingcurve during mesophilic and thermophilic conditions

擬合函數(shù)參數(shù)Fitting function parameters中溫Mesophilic高溫Thermophilic擬合系數(shù)R2Fitting coefficient0.984 80.985 0物料產(chǎn)沼氣潛力/L ABiogas production potential16.5118.12最大產(chǎn)沼氣速率/(L·d-1) μmMaximum gas production rate0.5190.454遲滯時(shí)間/d λLag time1.116.12

2.1.2 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化揮發(fā)性有機(jī)酸和pH值變化 中溫和高溫干式厭氧消化系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中揮發(fā)性有機(jī)酸和pH值的變化如圖2所示。釀酒廢糟原料中含有大量揮發(fā)性有機(jī)酸，導(dǎo)致2個(gè)條件下初始揮發(fā)性有機(jī)酸含量較高，隨著發(fā)酵進(jìn)行，中溫和高溫反應(yīng)器中的有機(jī)酸最終都被降解。中溫系統(tǒng)中VFAs從消化開(kāi)始就持續(xù)減少，32 d后被消耗殆盡，而高溫系統(tǒng)中VFAs直到44 d后才被完全降解。其中，乳酸在中溫和高溫系統(tǒng)中快速降解，6 d后幾乎沒(méi)有乳酸被檢測(cè)到；乙酸和丁酸在21 d有少量積累，之后幾乎沒(méi)有被檢出；丙酸則在消化過(guò)程中不斷積累。丙酸在中高溫反應(yīng)器中均先增加后降低，但中溫系統(tǒng)中丙酸積累在6 d達(dá)到最大值，為1 477.54 mg·kg-1，隨后逐漸降低在32 d被完全消耗，而高溫系統(tǒng)中丙酸積累在32 d達(dá)到最大值，為1 939.76 mg·kg-1，隨后逐漸降低在44 d被消耗完畢。2個(gè)系統(tǒng)pH值在6 d之前略微下降，之后隨著揮發(fā)性有機(jī)酸消耗，pH值開(kāi)始逐漸上升，最終中溫和高溫反應(yīng)器pH值分別為8.55和8.43，均在厭氧消化適合pH范圍內(nèi)。

2.1.3 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化丙酸含量與產(chǎn)沼氣速率變化 丙酸積累情況的不同會(huì)導(dǎo)致中溫和高溫條件下釀酒廢糟產(chǎn)沼氣速率的差異，丙酸含量和產(chǎn)沼氣速率的變化情況如圖3所示。2個(gè)系統(tǒng)中產(chǎn)沼氣速率均先增加后降低，但中溫系統(tǒng)中產(chǎn)沼氣速率在12 d達(dá)到最大值，為0.517 L·d-1，隨后逐漸降低至幾乎不產(chǎn)沼氣，而高溫系統(tǒng)中產(chǎn)沼氣速率在20 d達(dá)到最大值，為0.453 L·d-1，隨后逐漸降低至較小值。不同溫度下產(chǎn)沼氣速率的變化趨勢(shì)與丙酸相似。在整個(gè)厭氧消化過(guò)程中，中溫系統(tǒng)在最大丙酸含量低于高溫系統(tǒng)的同時(shí)獲得了更大的最大產(chǎn)沼氣速率，而且中溫系統(tǒng)中最大產(chǎn)沼氣速率出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)和丙酸含量開(kāi)始下降的時(shí)間點(diǎn)均早于高溫系統(tǒng)。由此可見(jiàn)，高溫系統(tǒng)中丙酸積累持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)且最大丙酸含量較高，而中溫系統(tǒng)在前期的產(chǎn)沼氣速率大于高溫系統(tǒng)，丙酸積累對(duì)高溫系統(tǒng)的抑制程度強(qiáng)于中溫系統(tǒng)。

2.2 微生物群落解析

2.2.1 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化微生物群落對(duì)比 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化微生物整體群落組成如圖4所示。從基于OTU水平的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)的結(jié)果可以看出，微生物群落聚類為3簇：第1簇為M_0和T_0，由于初始接種污泥均來(lái)自中溫厭氧消化系統(tǒng)，因此起始的微生物結(jié)構(gòu)相似；第2簇為中溫過(guò)程的所有樣品；第3簇為高溫過(guò)程的所有樣品。這說(shuō)明微生物群落結(jié)構(gòu)在中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程中存在著顯著的差異。此外，中溫和高溫系統(tǒng)微生物群落在發(fā)酵過(guò)程中也顯示出逐漸變化的趨勢(shì)。

圖2 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程有機(jī)酸和pH的變化

圖3 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程丙酸和產(chǎn)氣速率的變化

2.2.2 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化細(xì)菌門水平對(duì)比 圖5和圖6分別顯示了釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程中微生物群落在門水平的結(jié)構(gòu)演替和組間差異。16S rRNA測(cè)序共檢測(cè)到9個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，分別是熱袍菌門(Thermotogae)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、共溫菌門(Coprothermobacteraeota)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋體門(Spirochaetes)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)。其中，熱袍菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是主要優(yōu)勢(shì)菌門，整體相對(duì)豐度為51.63%～83.76%，共溫菌門、變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、螺旋體門和互養(yǎng)菌門為第二優(yōu)勢(shì)菌門，整體相對(duì)豐度為16.25%～45.12%。分析中溫和高溫組間細(xì)菌門水平差異，可以看出熱袍菌門、擬桿菌門和螺旋體門在中高溫系統(tǒng)中差異較大。在中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程中，熱袍菌門開(kāi)始相差不大，隨后均逐漸增加，在21 d后保持相對(duì)穩(wěn)定，但高溫系統(tǒng)中熱袍菌門在前21 d增幅較大。中溫系統(tǒng)中擬桿菌門在開(kāi)始就高于高溫系統(tǒng)，隨后迅速增加，在6 d后保持相對(duì)穩(wěn)定，而高溫系統(tǒng)中擬桿菌門逐漸降低直到發(fā)酵結(jié)束。高溫系統(tǒng)中未檢測(cè)到螺旋體門，但中溫系統(tǒng)中螺旋體門逐漸增加至消化結(jié)束。其他細(xì)菌門如厚壁菌門均緩慢降低；共溫菌門、變形菌門和互養(yǎng)菌門均一直在波動(dòng)，但波動(dòng)范圍不大；放線菌門在中溫系統(tǒng)中相對(duì)穩(wěn)定，在高溫系統(tǒng)中略有降低；綠彎菌門均一直降低。從整體上看，這些細(xì)菌門有差異，但不顯著。

圖4 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程微生物群落結(jié)構(gòu)PCoA分析

2.2.3 釀酒廢糟中溫和高溫系統(tǒng)干式厭氧消化細(xì)菌屬水平對(duì)比 圖7和圖8分別顯示了釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程中微生物群落在屬水平的結(jié)構(gòu)演替和組間差異?？梢钥闯?，Defluvii-toga、Proteiniphilum、Coprothermobacter、Petrimonas、Clostridium_Sensu_stricto_8、Sphaerochaeta、Clostridium_sensu_stricto_1、Bacteroides等屬是釀酒廢糟干式厭氧消化過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)屬。分析中溫和高溫干式厭氧消化系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)屬之間的物種差異，發(fā)現(xiàn)Defluviitoga、Petrimonas、Clostridium_sensu_stricto_8在2個(gè)厭氧消化系統(tǒng)中差異較大。在中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程中，Defluviitoga開(kāi)始相差不大，隨后均逐漸增加，在21 d后保持相對(duì)穩(wěn)定，但高溫系統(tǒng)中Defluviitoga在前21 d增速較快。Petrimonas在中溫系統(tǒng)中迅速增加，隨后逐漸降低，但在高溫系統(tǒng)中未被檢測(cè)到。Clostridium_sensu_stricto_8在高溫系統(tǒng)中迅速增加，隨后逐漸降低，但在中溫系統(tǒng)中未被檢測(cè)到。其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬如Proteiniphilum和Clostridium_sensu_stricto_1在中溫系統(tǒng)中保持相對(duì)穩(wěn)定，在高溫系統(tǒng)中先增加后降低；Coprothermobacter均先降低后增加；Sphaerochaeta在中溫系統(tǒng)逐漸增加，在高溫系統(tǒng)中未被檢測(cè)到；Bacteroides在中溫系統(tǒng)先增加后降低，在高溫系統(tǒng)中相對(duì)豐度很低。從整體上看，這些細(xì)菌屬有差異，但不顯著。

圖5 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化細(xì)菌門水平組成

2.2.4 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化古菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)比 圖9顯示了釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化古菌屬水平組成及演替?？梢钥闯?，隨著厭氧消化過(guò)程的進(jìn)行，中溫和高溫干式厭氧消化系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷菌的種類和豐度均發(fā)生了較大改變。中溫和高溫系統(tǒng)的初始古菌屬組成存在著明顯差異，其中高溫系統(tǒng)中甲烷囊菌(Methanoculleus)、甲烷熱桿菌(Methanothermobacter)和甲烷桿菌(Methanobacterium)顯著高于中溫系統(tǒng)，而甲烷八疊球菌(Methanosarcina)的相對(duì)豐度低于中溫系統(tǒng)。2個(gè)系統(tǒng)的初始接種污泥均來(lái)自中溫系統(tǒng)，分別在中溫和高溫系統(tǒng)中馴養(yǎng)7 d后古菌群落發(fā)生了顯著的變化，高溫系統(tǒng)出現(xiàn)了其獨(dú)有的甲烷熱桿菌，其相對(duì)豐度先降低后增加，釀酒廢糟添加后中溫系統(tǒng)出現(xiàn)了獨(dú)有的甲烷泡菌(Methanofollis)，且相對(duì)豐度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。隨著厭氧消化的進(jìn)行，2個(gè)系統(tǒng)中甲烷囊菌隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行相對(duì)豐度逐漸增加，而甲烷八疊球菌與甲烷囊菌的變化趨勢(shì)則相反，2個(gè)系統(tǒng)中其他種類產(chǎn)甲烷菌豐度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中保持穩(wěn)定。

圖6 細(xì)菌門水平組間差異顯著性檢驗(yàn)

圖7 釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化細(xì)菌屬水平組成

圖8 細(xì)菌屬水平組間差異顯著性檢驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

厭氧消化是多種微生物共同作用的生物化學(xué)過(guò)程。累計(jì)產(chǎn)沼氣體積表明，在中溫和高溫條件下，利用釀酒廢糟作為底物進(jìn)行干式厭氧消化的最終累積產(chǎn)沼氣體積差異較小。在本研究中，20 d之前中溫系統(tǒng)的產(chǎn)沼氣速率高于高溫系統(tǒng)，之后高溫系統(tǒng)的產(chǎn)沼氣速率高于中溫系統(tǒng)，推測(cè)是因?yàn)槭冀臃N污泥均為中溫污泥，初始微生物群落結(jié)構(gòu)可能更適應(yīng)中溫環(huán)境，導(dǎo)致中溫系統(tǒng)遲滯期較短，且20 d之前中溫系統(tǒng)產(chǎn)沼氣速率較高，之后因?yàn)楦邷叵到y(tǒng)微生物群落經(jīng)過(guò)充分馴化，活性提升導(dǎo)致高溫系統(tǒng)的產(chǎn)沼氣速率較高。發(fā)酵進(jìn)行至40 d時(shí)中溫和高溫系統(tǒng)的累積產(chǎn)沼氣體積相差不大，表明此時(shí)易被降解的有機(jī)物幾乎降解完全，之后累積產(chǎn)沼氣體積略微增加主要是由剩余難降解物質(zhì)如木質(zhì)纖維素成分導(dǎo)致。揮發(fā)性有機(jī)酸積累情況表明，乳酸、乙酸和丁酸在前期迅速降解，但丙酸在前中期有一定積累，且高溫系統(tǒng)中丙酸積累持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，最大積累含量也高于中溫系統(tǒng)。VEEKEN等[23]發(fā)現(xiàn)溫度由20 ℃提高到40 ℃時(shí)，厭氧反應(yīng)中生成丙酸的一級(jí)水解速率常數(shù)由0.03～0.15 d-1提高到0.24～0.47 d-1，這也說(shuō)明在高溫下丙酸可能更容易積累。丙酸轉(zhuǎn)化為乙酸和氫氣所需的吉布斯自由能較高，是所有揮發(fā)性有機(jī)酸中轉(zhuǎn)化為乙酸和氫氣最慢的。周曉臣[24]發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器過(guò)多的丙酸不僅影響復(fù)雜有機(jī)化合物向丙酸的轉(zhuǎn)化，也影響丙酸向乙酸和氫氣的轉(zhuǎn)化，從而抑制了產(chǎn)甲烷過(guò)程。BARREDO等[25]發(fā)現(xiàn)當(dāng)丙酸含量為1 500～2 220 mg·L-1時(shí)，產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量隨丙酸濃度的上升呈指數(shù)下降。這表明中溫和高溫反應(yīng)器快速產(chǎn)氣期的不同有可能和丙酸含量差異相關(guān)。

圖9 釀酒廢糟中高溫干式厭氧消化古菌屬水平組成

溫度是影響厭氧消化過(guò)程微生物群落的重要因子，影響微生物的生長(zhǎng)和繁殖[26]。在初始接種污泥來(lái)源相同的情況下，發(fā)酵溫度的差異會(huì)給菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)整帶來(lái)選擇壓力[27]。細(xì)菌門水平差異分析發(fā)現(xiàn)，熱袍菌門在高溫系統(tǒng)的平均相對(duì)豐度達(dá)到了39.61%，而中溫時(shí)只有14.32%。研究表明熱袍菌門物種多為嗜熱菌，并可利用多種碳源包括己糖、戊糖、葡聚糖、木聚糖、果膠和纖維素等作為基質(zhì)[28]；擬桿菌門是可以水解纖維素、半纖維素和幾丁質(zhì)等多糖物質(zhì)的菌群，在中溫系統(tǒng)中平均相對(duì)豐度達(dá)到了33.73%，而在高溫系統(tǒng)中僅10.51%。螺旋體門只在中溫系統(tǒng)中被檢測(cè)到，其相對(duì)豐度為5.29%，包含多種致病菌種，這說(shuō)明高溫有利于殺死病原菌。細(xì)菌屬水平分析發(fā)現(xiàn)，Defluviitoga在高溫系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)顯著，其具有纖維素降解能力，最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃，可降解纖維素為乙酸、氫氣和二氧化碳[29]。有研究對(duì)比了餐廚垃圾與秸稈混合物中溫和高溫共消化系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)高溫系統(tǒng)的木質(zhì)纖維素降解細(xì)菌和放線菌具有明顯優(yōu)勢(shì)，且體系的木質(zhì)纖維素降解率高于中溫體系[30]。由于釀酒廢糟為高木質(zhì)纖維素物料，所以推測(cè)高溫系統(tǒng)的最終沼氣產(chǎn)量略高于中溫系統(tǒng)是由更多木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的降解引起的。Petrimonas是中溫系統(tǒng)的獨(dú)有菌屬，主要以糖類為底物。有研究報(bào)道，Petrimonas是以香菇和雙孢菇基質(zhì)為底物的中溫半連續(xù)厭氧發(fā)酵的重要優(yōu)勢(shì)物種[31]。Clostridium是高溫系統(tǒng)的獨(dú)有菌屬，梭菌菌群為中溫和高溫厭氧消化過(guò)程中普遍存在的水解酸化菌群，有研究表明該菌群能在高溫條件下成為優(yōu)勢(shì)菌種[32]。在古菌屬水平上，釀酒廢糟干式厭氧消化開(kāi)始時(shí)，高溫系統(tǒng)出現(xiàn)了其獨(dú)有的甲烷熱桿菌，中溫系統(tǒng)出現(xiàn)了獨(dú)有的甲烷泡菌，表明溫度對(duì)古菌群落的影響較大。釀酒廢糟干式厭氧消化結(jié)束時(shí)，中溫系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌豐度占比前3的為甲烷囊菌、甲烷八疊球菌和甲烷桿菌，高溫系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌豐度占比前3的為甲烷囊菌、甲烷熱桿菌和甲烷桿菌。該變化表明，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌逐漸取代了乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。

綜上所述，釀酒廢糟中溫和高溫干式厭氧消化過(guò)程的累積沼氣產(chǎn)量相差不大，后續(xù)將采用經(jīng)釀酒廢糟馴化的污泥作為接種物，進(jìn)一步分析釀酒廢糟在中高溫條件下厭氧消化的差異。產(chǎn)氣速率在不同時(shí)段存在著較大差異，發(fā)酵前期中溫系統(tǒng)產(chǎn)氣速率高于高溫，而后期高溫系統(tǒng)高于中溫系統(tǒng)；高溫有有機(jī)酸尤其是丙酸存在積累的風(fēng)險(xiǎn)。中溫和高溫系統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異明顯，熱袍菌門是高溫系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，擬桿菌門和螺旋體門是中溫系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門；細(xì)菌屬水平上，高溫系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌屬為Defluviitoga和Clostridium，中溫系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)菌屬為Petrimonas。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，中溫和高溫系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷菌群落均由乙酸營(yíng)養(yǎng)型占優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變?yōu)闅錉I(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌占優(yōu)勢(shì)，但2個(gè)系統(tǒng)的產(chǎn)甲烷菌存在著明顯的差異，高溫系統(tǒng)出現(xiàn)了獨(dú)有的甲烷熱桿菌，而中溫系統(tǒng)出現(xiàn)了獨(dú)有的甲烷泡菌。