新型冠狀病毒ELISA試劑盒靈敏度和特異度評價

李德昌，張明霞，林大川，胡云龍，溫志華， 劉圣澤，徐羽中，黃開松，張 政，陳心春

1)粵北第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東韶關(guān) 512000; 2 )深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部-粵北第二人民醫(yī)院聯(lián)合實驗室，廣東深圳 518066; 3) 深圳市第三人民醫(yī)院國家感染性疾病臨床研究中心，廣東深圳 518112; 4)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣東深圳 518066; 5) 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518100

冠狀病毒在系統(tǒng)分類學(xué)上屬套式病毒目(Nidovirale)冠狀病毒科(Coronaviridae)， 具有囊膜，基因組為線性的單股正鏈核糖核酸病毒[1]．在2019年末新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)疫情爆發(fā)前，共有6株冠狀病毒導(dǎo)致人類群體感染事件．其中包括2003年在中國爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征和2012在中東地區(qū)開始爆發(fā)的中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒大規(guī)模感染事件[2-3]．目前，臨床診斷SARS-CoV-2的重要手段是探針反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)法，但其檢測效率通常只有30%～50%，導(dǎo)致需要多次檢測，甚至需提取下呼吸道如肺泡灌洗液才能減少漏檢[4]．對新型冠狀病毒抗體的檢測能提高對新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)的檢出率，是新型冠狀病毒核酸檢測診斷方法的重要輔助方法．本研究利用健康人群、結(jié)核病人和已確診的新型冠狀病毒病人的血清，對酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測新冠病人進(jìn)行了評估．

1 研究對象和方法

1.1 研究對象及樣本

本研究共采集10名健康人、46例結(jié)核患者和57例新型冠狀病毒感染者(以下簡稱新冠患者)的血液，用于血清學(xué)檢測．10名健康者血液樣品來源于中國深圳市南山區(qū)；46例確診結(jié)核患者血液樣品來源于深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院和粵北第二人民醫(yī)院；57例確診的新冠患者血樣為隨機招募，均來自深圳市第三人民醫(yī)院，核酸檢測均為陽性．健康者和結(jié)核病患者為對照組，均無報告的新型冠狀病毒流行病學(xué)史，且利用上海捷諾核酸檢測劑盒檢測連續(xù)兩次為陰性．采集所有參與者外周血5 mL，分別置于含肝素鈉的試管中充分混勻，于800g離心10 min制備血清，獲得的血清可即時檢測或-80 ℃下保存直至使用．

1.2 ELISA方法檢測SARS-CoV-2 特異性 IgM 抗體

本研究評估的新型冠狀病毒酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自珠海和北京廠家試劑公司(以下分別簡稱珠海試劑盒和北京試劑盒)．ELISA試劑盒開發(fā)的原理是以新型冠狀病毒SARS-CoV-2重組抗原(北京)或者抗人IgM μ鏈單克隆抗體(珠海 )先包被微孔板，隨后檢測血清中SARS-CoV-2特異性 IgM抗體或全部IgM抗體，最后利用酶標(biāo)記的抗人IgM 二抗或酶標(biāo)記的重組新型冠狀病毒抗原，最終檢測最后結(jié)合的血清中的新型冠狀病毒特異性 IgM 抗體．詳細(xì)檢測步驟、臨界值計算和陽性結(jié)果判斷參閱試劑盒說明書．

1.3 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均在GraphPad Prism 7軟件中進(jìn)行，采用卡方和費希爾精確檢驗分析比較不同組間差異．當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 研究結(jié)果

2.1 兩種酶聯(lián)免疫試劑盒的靈敏度和特異度

在對10名健康者、46例結(jié)核病患者和57例確診新冠患者血樣檢測中，珠海試劑盒分別檢出0例、6例假陽性和40例新冠陽性，靈敏度和特異度分別為70.1% 和89.2% ；北京試劑盒檢出結(jié)果分別為2例、7例假陽性和50 例新冠陽性，靈敏度和特異度分別為87.7%和83.9%(表1)．由表1此可見，北京試劑盒對新型冠狀病毒檢測的敏感性高于珠海試劑盒的， 綜合檢測效果更好．

2.2 IgM陽性結(jié)果與發(fā)病時間關(guān)系分析

在對患者發(fā)病時間和抗體IgM 檢測結(jié)果關(guān)系的分析中，發(fā)現(xiàn)珠海試劑盒在檢測發(fā)病時間超過14 d的患者時，IgM 檢測的陽性比例(26/30)明顯高于發(fā)病時間為0～14 d的患者(14/27)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)． 另外，北京試劑盒的檢測結(jié)果也顯示，相對于發(fā)病時間為0～14 d的群體(22/27)，發(fā)病時間超過14 d的患者的 IgM檢測陽性也高些(28/30)，但差異在統(tǒng)計學(xué)上不顯著．

表1 兩種酶聯(lián)免疫試劑盒檢測臨床 新冠病人敏感度和特異度評估Table 1 Sensitivity and specificity of two ELISA kits in the clinical diagnosis of SARS-CoV-2

表2 珠海試劑盒IgM 檢測率與 發(fā)病天數(shù)關(guān)系(P< 0.01)Table 2 Relation between detection rate by Zhuhai kit and onset time(P< 0.01) 例

3 討 論

決定血清學(xué)診斷效果因素有很多，如檢測的抗體類型． IgM較早于IgG抗體產(chǎn)生，因為IgM產(chǎn)生無需同型轉(zhuǎn)換，且表達(dá)會在感染后期下降，因此，在特異性方面IgG抗體類型檢測效果可能會好于IgM 類型的檢測，但在感染早期IgM檢測靈敏度可能會更高．本研究在兩種試劑盒檢測中，均在結(jié)核患者血樣中檢測到假陽性，可能與IgM固有的特異性問題相關(guān)．北京試劑盒最早包被于微孔板的是SARS-CoV-2重組N抗原，而珠海試劑盒包被于微孔板的是抗人IgM μ鏈的抗體，因此，北京試劑盒第1步捕獲的只有SARS-CoV-2的N蛋白特異性IgM抗體，而珠海試劑盒第1步捕獲的是所有IgM 抗體，包括SARS-CoV-2各種成分誘導(dǎo)形成的IgM抗體． 盡管珠海試劑盒最終顯色的也只有N抗原的IgM抗體，此差異是否跟兩種試劑盒檢測靈敏度差異相關(guān)需進(jìn)一步探索． 核酸檢測是新型冠狀病毒感染確診的重要方法，然而，該方法靈敏度不高、檢測時間長、所需設(shè)備要求高和操作步驟復(fù)雜，因此SARS-CoV-2抗體檢測方法逐漸被開發(fā)[5]．本研究結(jié)果確認(rèn)了對新型冠狀病毒抗體IgM的檢測具有臨床新型冠狀病毒檢測的可行性．