骨肉瘤患者新輔助化療后治療反應(yīng)的病理組織學(xué)評估

宮麗華 劉巍峰 李蘭 董榮芳 張文 張婷婷 牛曉輝 丁宜

骨肉瘤是最常見的好發(fā)于青少年的骨原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病高峰年齡為 10～20歲[1]。組織學(xué)上以典型的惡性腫瘤細(xì)胞直接成骨為特征。最常見轉(zhuǎn)移部位為肺。一旦發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移，患者進(jìn)入 Enneking III 期，導(dǎo)致治療困難及預(yù)后不良。化療藥物的應(yīng)用顯著促進(jìn)了骨肉瘤的外科手術(shù)治療進(jìn)程[2]，最近幾十年，由于新輔助化療與手術(shù)治療的結(jié)合，其5年無瘤存活率由新輔助化療應(yīng)用前的 20% 提高到60%～80%[3]。各種骨腫瘤專業(yè)書籍和指南均認(rèn)可術(shù)前化療 ( 新輔助 ) 的效果評價(jià)是提示骨肉瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一[1]。由于臨床及影像學(xué)評估意義有限，目前仍依賴于病理鏡下組織學(xué)的評估。因此，新輔助化療后骨肉瘤評估治療反應(yīng)時(shí)的標(biāo)本取材、鏡下形態(tài)觀察及新輔助治療后組織學(xué)改變評分的標(biāo)準(zhǔn)化操作就顯得十分重要。為此，筆者對本院 296例新輔助化療后骨肉瘤的腫瘤患者的治療反應(yīng)，進(jìn)行了回顧性組織學(xué)評估，現(xiàn)介紹如下。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1) 2014年 10月至 2018年 10月，就診于本院的骨肉瘤患者；( 2) 在本中心行穿刺化療前活檢和最終腫瘤切除手術(shù)者；( 3) 病理診斷明確為高級別骨肉瘤者；( 4) 臨床及影像學(xué)資料完整者；( 5) 患者知情并同意行術(shù)后病理壞死率評估者。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1) 術(shù)前僅有外院會診病理的高級別骨肉瘤者；( 2) 未行術(shù)前新輔助化療的截肢患者；( 3) 未行術(shù)后標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)壞死率評估者；( 4) 無化療前后連續(xù)影像學(xué)評估資料者。

二、臨床資料

本研究共納入 296例，女 100例，男 196例。年齡 8～49歲，平均 16歲。其中股骨 181例，脛骨 71例，肱骨 25例，腓骨 9例，橈骨 4例，髂骨4例，鎖骨 1例，尺骨 1例。

三、操作方法

本組所有標(biāo)本，術(shù)后均經(jīng) 2位病理醫(yī)師復(fù)核確立診斷。骨肉瘤化療后大體標(biāo)本治療反應(yīng)取材具體操作步驟如下：( 1) 骨腫瘤標(biāo)本沿長軸鋸開取最大徑薄片 ( 薄片厚度約 0.5cm )，薄片應(yīng)包括腫瘤主體和周圍組織，以及鄰近的皮質(zhì)、骨膜、骨髓、關(guān)節(jié)軟骨及軟組織交界區(qū)域等。經(jīng) 4% 中性緩沖甲醛液固定；( 2) 大體標(biāo)本照相，并復(fù)習(xí)手術(shù)前影像學(xué)資料核對腫瘤位置及大??；( 3) 對薄片標(biāo)本進(jìn)行脫鈣處理。經(jīng) 98% 甲酸與 4% 中性甲醛按以 1∶1比例配制脫鈣液，對標(biāo)本進(jìn)行脫鈣處理；( 4) 脫鈣完成后，對薄片進(jìn)行“網(wǎng)格”樣分割，按每 1cm 取材一塊劃分，并逐一編號 ( 圖 1)；( 5) 取材部分應(yīng)包括累及軟組織的部分，腫瘤與正常組織交界處等。石蠟包埋，3μm 切片并常規(guī) HE 染色；( 6) 鏡下進(jìn)行逐塊評估，計(jì)算每塊的治療反應(yīng) ( 即壞死所占比例 )，最后匯總數(shù)據(jù)。

四、評估標(biāo)準(zhǔn)

隨著新輔助化療方案在臨床的應(yīng)用，由 Huvos等[4]和 Rosen 等[5]倡導(dǎo)的化療后手術(shù)標(biāo)本取材和評估分級被全世界腫瘤中心所采納，該操作按照 CAP標(biāo)準(zhǔn) ( 文獻(xiàn) ) 主要由病理科完成，按照 Huvos 分級標(biāo)準(zhǔn)得出評估結(jié)果。Huvos 分級標(biāo)準(zhǔn)包括以下四級：Grade I：腫瘤細(xì)胞沒有或幾乎沒有壞死；Grade II：腫瘤細(xì)胞壞死超過 50%，某些切片中可以見到存活的腫瘤細(xì)胞；Grade III：腫瘤細(xì)胞壞死超過 90%，某些切片中可以見到灶狀存活的腫瘤細(xì)胞；Grade IV：任何切片中均未見到存活的腫瘤細(xì)胞。大多數(shù)研究化療與預(yù)后關(guān)系的數(shù)據(jù)表明，Grade I 與 Grade II 化療效果不好 (＜90% )，Grade III 與 Grade IV 化療效果好 ( ≥ 90% )。由于好的化療反應(yīng)具有更高的無病生存率[6]，因此，本研究將以 90% 為界進(jìn)行治療反應(yīng)的評估。在鏡下觀察時(shí)，完全無腫瘤細(xì)胞存在的正常組織將不包含在總體治療反應(yīng)的計(jì)算中。

五、壞死率的評估

以圖 1為例，本例標(biāo)本共取材 87片，49片中未見腫瘤細(xì)胞，有 38片中可見腫瘤細(xì)胞。38張切片中的正常組織排除在外，計(jì)算每張切片腫瘤細(xì)胞的壞死占腫瘤組織的比例：從 50%～95% 不等，對這 38個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行總和取平均值，即為最后整體組織的化療壞死率，本例壞死率計(jì)算結(jié)果 78%。按照Huvos 分級記為＜90%。

結(jié) 果

一、新輔助化療后病理評估

本組所有患者均行術(shù)前新輔助化療，化療方案為甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、阿霉素和順鉑四藥序貫進(jìn)行。其中 99例見皮質(zhì)破壞并伴有軟組織包塊。治療反應(yīng) Huvos 分級 ≥ 90% 為 140例，＜90% 為 156例。101例組織形態(tài)中可見腫瘤性軟骨成分，其中31例總體治療反應(yīng) ≥ 90%，余 70例均＜90%。

二、鏡下形態(tài)

圖1 新輔助化療后手術(shù)大體標(biāo)本地圖樣分格取材Fig.1Gross specimen after new adjuvant chemotherapy

在壞死率 ≥ 90% 的病例中，大部分腫瘤區(qū)域的腫瘤細(xì)胞消失，代之以纖維血管組織，間質(zhì)疏松水腫，纖維母細(xì)胞增生伴有膠原形成，其間可見反應(yīng)性的較成熟的新骨，骨周見骨母細(xì)胞圍繞。纖維組織內(nèi)可見出血，或表現(xiàn)為灶、片狀出血，或表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、瘀血 ( 圖 2)。纖維組織及壞死組織內(nèi)散在退變的瘤細(xì)胞：核大，深染，核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，部分胞質(zhì)紅染，可見瘤巨細(xì)胞及多核瘤細(xì)胞 ( 圖 3)。大片壞死的腫瘤細(xì)胞也可表現(xiàn)為鬼影細(xì)胞形態(tài)。由于瘤細(xì)胞受化療的影響而骨樣基質(zhì)依然存在，花邊樣腫瘤骨周圍可見高度異型的腫瘤細(xì)胞 ( 圖 4)。在治療反應(yīng)＜90% 的病例中，可見灶片狀存在的瘤組織，細(xì)胞形態(tài)可受化療影響而呈現(xiàn)細(xì)胞核的改變 ( 圖 5)。小細(xì)胞骨肉瘤化療后可見小圓形的骨肉瘤細(xì)胞，細(xì)胞周圍見幼稚的花邊樣腫瘤骨 ( 圖 6)。毛細(xì)血管擴(kuò)張型骨肉瘤可見囊性結(jié)構(gòu)，囊壁內(nèi)見腫瘤性新生骨，細(xì)胞伴退變性改變 ( 圖 7)。成軟骨為主型骨肉瘤中，軟骨成分不受化療影響，可見軟骨呈結(jié)節(jié)狀 ( 圖 8) 或片狀存在( 圖 9)。成纖維為主型骨肉瘤化療后可見瘤細(xì)胞以梭形為主 ( 圖 10)，化療反應(yīng)好的區(qū)域瘤細(xì)胞消失，代之以玻璃樣變性的粗大膠原纖維，殘存瘤細(xì)胞呈現(xiàn)化療后改變。

圖2 纖維化組織中見出血、血管擴(kuò)張及反應(yīng)性新骨形成 ( HE × 10)圖3壞死瘤組織內(nèi)見核退變的瘤細(xì)胞 ( HE × 40)圖4花邊狀骨周圍見核退變的瘤細(xì)胞 ( HE × 40)圖5化療反應(yīng)較差的瘤組織顯示細(xì)胞存活 ( HE × 20)圖6小細(xì)胞骨肉瘤化療后細(xì)胞核固縮，細(xì)胞周圍見幼稚的骨樣基質(zhì) ( HE × 20)圖7毛細(xì)血管擴(kuò)張型骨肉瘤化療后改變 ( HE × 40)圖8成軟骨為主型骨肉瘤中的結(jié)節(jié)狀軟骨幾乎不受化療影響 ( HE × 20)圖9成軟骨為主型骨肉瘤中的片狀軟骨幾乎不受化療影響 ( HE × 20)圖10成纖維型骨肉瘤顯示梭形的存活瘤細(xì)胞 ( HE × 20)Fig.2Bleeding, vasodilation, and reactive new bone formation in fibrotic tissues ( HE × 10)Fig.3Tumor cells with nuclear degeneration in necrosis tissues ( HE × 40)Fig.4Ιrregular tumor tissues surrounded by degenerated tumor cells ( HE × 40)Fig.5Surviving tumor cells in the poor response areas ( HE × 20)Fig.6Karyopyknosis was observed after chemotherapy and the immature osteoid existed in small osteosarcoma ( HE × 20)Fig.7Features of telangiectatic osteosarcoma after chemotherapy ( HE × 40)Fig.8Nodular cartilage without chemotherapy reactions in chondroblastic osteosarcoma ( HE × 20)Fig.9Cartilage flakes without chemotherapy reactions in chondroblastic osteosarcoma ( HE × 20)Fig.10Surviving spindle tumor cells after chemotherapy in fibroblastic osteosarcoma ( HE × 20)

討 論

治療反應(yīng)基于化療后壞死腫瘤細(xì)胞與存活腫瘤細(xì)胞的比例，用于評價(jià)對化療藥物的敏感性。在治療中存活的細(xì)胞被認(rèn)為是藥物抵抗性的，即化療抵抗性細(xì)胞。當(dāng)前，評價(jià)骨肉瘤預(yù)后的因素包括年齡、性別、腫瘤位置、大小及臨床分期等，但最重要的指標(biāo)是腫瘤組織對術(shù)前化療的反應(yīng)[7-10]。Bacci等[11]對 789例肢體骨肉瘤經(jīng)新輔助化療后的預(yù)后因素進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)治療的差反應(yīng)是非轉(zhuǎn)移性肢體骨肉瘤預(yù)后評估中非常有價(jià)值的獨(dú)立因素。在高級別骨肉瘤的亞型中，成纖維型骨肉瘤與毛細(xì)血管擴(kuò)張型較骨母細(xì)胞型與成軟骨型骨肉瘤的化療反應(yīng)更好[12]。盡管如此，研究表明成軟骨為主型與更好的長期存活率相關(guān)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于普通型骨肉瘤中以成軟骨為主時(shí)，由于成軟骨腫瘤細(xì)胞對化療的不敏感性，化療過程中并不壞死，因此腫瘤性軟骨的存在及其量的多少將影響總體治療反應(yīng)評估。本組的組織形態(tài)中包含軟骨的 101例骨肉瘤患者，70% 的患者對治療的反應(yīng)＜90%，提示軟骨在治療反應(yīng)高低的評價(jià)中占一定的作用。

病理解剖和外科病理主任協(xié)會 ( association of directors of anatomic and surgical pathology，ADASP )于 2004年規(guī)范了骨肉瘤化療的療效評判標(biāo)準(zhǔn)[15]。由于尤文氏肉瘤及骨的惡性纖維組織細(xì)胞瘤與骨肉瘤的生存率、治療及治療后反應(yīng)相似，故此評判標(biāo)準(zhǔn)也適用于這兩種腫瘤。治療反應(yīng)以壞死所占所有腫瘤面積的百分?jǐn)?shù)表示。研究顯示化療誘導(dǎo)的壞死達(dá)到或超過 90% 以上則具有 90% 的無病存活率，而低于 90% 則無病存活率降至 15% 以下[16]。

一、推薦取材方法

最初的取材方法曾推薦將腫瘤標(biāo)本全部取材或者三維立體取材等，顯然這些方法繁冗而不現(xiàn)實(shí)，在繁忙的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中心幾乎無法完成。后來隨著經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)的積累，且經(jīng)過歐美很多腫瘤中心反復(fù)嘗試，推薦一種比較簡單的骨肉瘤新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本取材標(biāo)準(zhǔn)方法。即：對大體標(biāo)本沿最大徑取代表性的一個(gè)薄片，約 5mm 厚，進(jìn)行分格畫圖并標(biāo)號以顯示每一塊所在的位置，其中不僅包括腫瘤組織，也包括可能被化療效果所屏蔽的周圍軟組織、腫瘤結(jié)節(jié)、皮質(zhì)骨、皮質(zhì)下髓腔、軟骨以及韌帶等。最后經(jīng)脫鈣后取材 1塊 / cm。同時(shí)，應(yīng)該詳細(xì)描述標(biāo)本的大小 ( 長徑與最大橫徑 )、腫瘤的大小、位置、有無皮質(zhì)的侵犯及軟組織包塊形成、髓腔侵犯程度、是否累及骺軟骨、關(guān)節(jié)軟骨以及有無骨內(nèi)跳躍灶。

二、推薦判讀方法

對于腫瘤壞死的界定具有一定的困難和主觀性。ADASP 指南中指出骨母細(xì)胞型及成軟骨為主型中，瘤細(xì)胞的缺失，僅在骨樣基質(zhì)及軟骨樣基質(zhì)中留下空的陷窩提示為化療后腫瘤壞死。成軟骨為主型骨肉瘤中，?？梢姟肮碛凹?xì)胞”，殘存瘤細(xì)胞核固縮或呈邊界不清的嗜堿性。在成纖維型或小細(xì)胞骨肉瘤中，與尤文氏肉瘤相似，其腫瘤壞死表現(xiàn)為細(xì)胞性成分被纖維組織及肉芽組織取代，可伴慢性炎細(xì)胞浸潤。毛細(xì)血管擴(kuò)張型骨肉瘤化療后顯示殘存充滿血液的囊壁成分，散在含鐵血黃素沉積，可見殘存異型細(xì)胞。在化療后切片中，總能見到一些細(xì)胞：核顯著異型性，染色質(zhì)團(tuán)塊狀，胞質(zhì)空泡狀，其往往僅占切片面積的小部分，究竟是對化療反應(yīng)的一種體現(xiàn)還是反應(yīng)性表現(xiàn)，目前意義不明。為盡可能降低評估的主觀性，這種細(xì)胞被認(rèn)為是存活的腫瘤細(xì)胞。因此，在評估治療反應(yīng)時(shí)，不考慮細(xì)胞形態(tài)改變，僅評判瘤細(xì)胞存在與否[17-19]。在鑒別腫瘤的原發(fā)性壞死與化療后壞死幾乎不可能，指南推薦如果腫瘤壞死同時(shí)存在纖維母細(xì)胞增生及含鐵血黃素沉積，則認(rèn)為是化療后反應(yīng)。在受侵犯的軟組織、皮質(zhì)、關(guān)節(jié)軟骨、韌帶中，常可見到存活的腫瘤細(xì)胞，而壞死更多集中于腫瘤的中心部位。對于這種壞死分布的傾向性，Picci 等[20]認(rèn)為腫瘤的血管是主要因素。與腫瘤內(nèi)部大量的新生血管相比，軟骨、皮質(zhì)及周圍韌帶、軟組織中的血管相對不豐富，因此難以產(chǎn)生高濃度化療藥物蓄積，故使腫瘤細(xì)胞得以存活。

三、推薦評價(jià)系統(tǒng)

除了 Huvos 評分系統(tǒng)外，目前對于化療后組織學(xué)評估還存在其它評價(jià)系統(tǒng)，如 Rosen 等[5]、Wold[18]、Picci 等[20]及 Raymond 等[16]分級，除了Raymond 對壞死率進(jìn)行粗略定量外，其余幾種皆對壞死后比例進(jìn)行分級，將其分為 4～5級。Rosen 評分 I 級極少或無化療后壞死；II 級部分反應(yīng)，＜50%壞死；III 級＞90% 壞死；IV 級無存活細(xì)胞。Picci 評分：好：＞90% 壞死；中：60%～90% 壞死；差：＜60% 壞死。Wold 評分：I：無效果；II：部分壞死 ( 包括 A：＞50% 存活細(xì)胞；B：5%～50% 存活細(xì)胞 )；III：散在存活細(xì)胞 (＜5% 存活細(xì)胞 )；IV：無存活細(xì)胞。目前，Huvos 評分系統(tǒng)被世界各地醫(yī)學(xué)機(jī)構(gòu)較為廣泛接受。

此外，骨肉瘤化療后病理報(bào)告應(yīng)該包括以下信息：手術(shù)標(biāo)本類型是截肢術(shù)還是保肢術(shù)；標(biāo)本的解剖部位；腫瘤大體特征包括腫瘤的位置、大小 ( 長徑及橫徑 cm )、距離斷端的距離；與鄰近組織的關(guān)系包括骺軟骨、關(guān)節(jié)軟骨；皮質(zhì)骨、周圍軟組織及可能的淋巴結(jié)，有無跳躍灶。鏡下形態(tài)包括腫瘤組織學(xué)分型、組織形態(tài)描述，壞死比例及邊緣情況。

通過對骨肉瘤患者治療反應(yīng)后的組織學(xué)評估，可以對骨肉瘤化療后反應(yīng)做出反饋，提示臨床醫(yī)師化療藥物的篩選是否合理，同時(shí)也是患者預(yù)后評估的重要依據(jù)。

四、局限性

雖然本研究進(jìn)行了大量骨肉瘤術(shù)后標(biāo)本的壞死率評估分析，但仍存在如下不足：( 1) 本組病例目前為止跟蹤隨訪時(shí)間未到 5年，缺乏標(biāo)準(zhǔn)生存率的數(shù)據(jù)，根據(jù)化療后反應(yīng)評估結(jié)果與患者預(yù)后進(jìn)行有效統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，了解二者之間的關(guān)系目前還無法完成；( 2) 對于病理壞死率和化療后影像學(xué)評估尚未建立關(guān)聯(lián)機(jī)制，如能夠?qū)⒂跋駥W(xué)評估參數(shù)與病理評估進(jìn)行結(jié)合，更能給臨床提供判斷權(quán)重，并且尋找二者一致性和異質(zhì)性評價(jià)；( 3) 未對不同手術(shù)方式及外科邊界與病理壞死率進(jìn)行分組分析，臨床治療抉擇與壞死率的關(guān)系未進(jìn)一步闡述；( 4) 病理壞死率的評價(jià)方式目前還是比較單一，對于真實(shí)世界數(shù)據(jù)的評估，有待于不斷完善參數(shù)的引入，以期能夠不斷修正和輔助臨床的判斷和治療。