IHH 信號轉(zhuǎn)導與骨關節(jié)炎患者軟骨代謝的研究進展

許肖 劉芳 劉紹靈

骨關節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 是關節(jié)軟骨的局部損傷和丟失、異常重塑和磨損、局部炎癥等一系列病理改變導致的退行性變[1]。關節(jié)軟骨是覆蓋于關節(jié)的表面的一層透明軟骨，大約由 5% 軟骨細胞和 95% 基質(zhì)構(gòu)成，基質(zhì)以蛋白多糖凝膠以及 II 型膠原為主，有著承受機械負荷、潤滑關節(jié)、防止磨損等重要作用[2]。成人關節(jié)軟骨細胞處于一種“生長停滯狀態(tài)”，當 OA 發(fā)生時，軟骨細胞出現(xiàn)了一種類似于軟骨內(nèi)成骨的分化過程：軟骨細胞肥大、終末分化、骨化、最后凋亡[3-4]，而在這一過程中，人體內(nèi)出現(xiàn)了一系列膠原蛋白、非膠原蛋白以及細胞因子的改變或可作為用于臨床診治 OA 的相關生物標志物。

近年來發(fā)現(xiàn)的 OA 相關生物標志物多達 10余種[5]，其中非膠原蛋白類相關標志物的代表印度刺猬 ( Indian hedgehog，IHH ) 被證明與 OA 患者軟骨代謝高度相關，可能在 OA 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。大量學者就IHH 與 OA 軟骨的相關關系作了大量的動物及臨床研究：Thompson 等[6]發(fā)現(xiàn) IHH 蛋白在健康成人的軟骨中幾乎檢測不到，但軟骨損傷早期表達會增加；Zhang 等[7]也發(fā)現(xiàn)，在早期人關節(jié)軟骨損傷中，IHH 基因表達上調(diào)；Mak等[8]通過上調(diào)出生后軟骨中的刺猬 ( hedgehog，HH )信號發(fā)現(xiàn)軟骨細胞肥大加速，進而導致關節(jié)軟骨的減少，認為降低 Ihh 的活性具有軟骨保護效應。Murakami 等[9]觀察成年大鼠股骨骨折愈合過程時，發(fā)現(xiàn) IHH 在軟骨細胞和成骨細胞中表達，這提示 IHH 是軟骨內(nèi)骨化的調(diào)節(jié)因子。張潔靖[10]研究氟中毒大鼠軟骨損害的影響時發(fā)現(xiàn)氟中毒主要通過 HH 信號通路損傷大鼠軟骨細胞活性和凋亡，提示 IHH 參與軟骨損傷的活動過程。王春理等[11]發(fā)現(xiàn)大鼠 OA 進展過程中 IHH 基因的表達量在早期有明顯的升高階段。孫一松等[12]通過離斷前交叉韌帶制造大鼠骨關節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn) IHH 表達水平在骨關節(jié)炎的早期即明顯升高，認為 IHH 在骨關節(jié)炎的退變過程中起重要作用。然而 IHH 與 OA 發(fā)生發(fā)展時軟骨代謝的作用機制尚不明確，現(xiàn)就 IHH 與 OA 軟骨代謝的相關關系作一綜述。

一、IHH 概述

早在 20世紀 70年代，有學者在研究果蠅基因突變時就首次了發(fā)現(xiàn) HH 基因[13]。之后在小鼠基因組中確定了脊椎動物的三個 HH 同源基因，編碼 3種 HH 蛋白：音速刺猬 ( sonic hedgehog，SHH )，沙漠刺猬 ( desert hedgehog，DHH ) 以及 IHH。在小鼠胚胎中，SHH、DHH 和 IHH 在牙齒、頭發(fā)、胡須、皺襞、腸道、膀胱、尿道、輸精管、肺、施萬和滋養(yǎng)細胞前體以及軟骨中表達，表明 HH 信號在哺乳動物發(fā)育中的重要作用[14]。在軟骨內(nèi)成骨的過程中，IHH 主要由前肥大軟骨細胞產(chǎn)生和分泌，并調(diào)節(jié)生長板軟骨發(fā)育過程[15]。目前對于 IHH 調(diào)節(jié)軟骨代謝的作用機制主要包括 HH-Gli 信號通路、IHH-PTHrP 信號軸、誘導骨髓間充質(zhì)干細胞 ( bone marrow stromal cells，BMSCs )分化等。

二、HH-Gli 信號通路

HH-Gli 信號通路首先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，并在脊椎動物中得到了證實，通路包括 HH 蛋白、膜受體 Patched( Ptc ) 蛋白、膜受體 Smoothened ( Smo ) 蛋白、膠質(zhì)細胞瘤轉(zhuǎn)錄因子 ( glioma-associated oncogene homologue，Gli ) 和下游靶基因[16]。Ptc 是 HH 的受體，本質(zhì)是一種 12通道的跨膜糖蛋白，同時也是一種補體蛋白，包含兩種同源基因Ptc1與 Ptc2，其主要表達于臨近軟骨膜區(qū)的細胞。在果蠅中，HH 通過抑制 Ptc 而發(fā)揮作用，在小鼠中也發(fā)現(xiàn)了 Ptc的同源基因，Ptc 在許多組織中是在分泌 SHH 與 IHH 的細胞附近轉(zhuǎn)錄，而這顯示了 HH 信號的接收[17]。Smo 蛋白是一種 7通道的跨膜蛋白，屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體超家族，也被提出是 HH 的受體。為了驗證 Smo 的作用，Chen 等[18]通過純合子細胞對 Smo 進行克隆進行驗證實驗，發(fā)現(xiàn) HH的信號轉(zhuǎn)導需要 Smo 蛋白。朱志堅等[19]將 Smo siRNA 序列經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到原代軟骨細胞中，以抑制 Smo 的表達，并觀察軟骨細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)沉默 Smo 后細胞凋亡率顯著上升，認為 Smo 具有保護軟骨細胞免遭凋亡的作用。Taipale 等[20]研究發(fā)現(xiàn) Ptc 和 Smo 在具有 HH 表達的細胞中沒有明顯的關聯(lián)，游離的 Ptc 通過改變小分子的分布或濃度，從而間接抑制 Smo 的活性，并通過抑制狀態(tài)的 Gli 阻遏下游基因的表達[21]，可以認為 Ptc 對 Hedgehog信號通路有負性調(diào)節(jié)作用 。當 IHH 信號出現(xiàn)時，其與 Ptc結(jié)合會使 Ptc 失活，從而使 Smo 的抑制被解除，并且激活Smo 使 Hedgehog 信號轉(zhuǎn)到至胞內(nèi)[22]，使活性的 Gli 進入細胞核，提高下游靶點的轉(zhuǎn)錄水平。Gli 是位于 HH-Gli 通路末端的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，脊椎動物中包含 Glil、Gli2與 Gli3三種因子，其中 Glil、Gli2是轉(zhuǎn)錄促進因子，Gli3是轉(zhuǎn)錄抑制因子[23]，直接調(diào)控著下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Gli1作為主要的轉(zhuǎn)錄因子，其水平的升高提示著 HH 信號通路的激活[24]。IHH 信號通過 HH-Gli 信號通路激活 Gli 后，可誘導轉(zhuǎn)錄因子 Runx2的表達，從而導致軟骨細胞的肥大[25]。

細胞周期調(diào)控因子 D1( Cyclin D1) 是 HH-Gli 信號通路下游的靶基因之一，參與細胞周期 G1期的調(diào)控，位于11q13，cDNA 為 4.3Kb，被鑒定為原癌基因，在 G1期早期表達[26]。軟骨細胞在特定的調(diào)控模式下進行增殖和分化，從而使長骨縱向生長，Yang 等[27]在研究了 Wnt 家族的兩個成員 Wnt5a 和 Wnt5b 在長骨發(fā)育中的作用時，通過敲除小鼠的 IHH 或 Smo 基因，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞增殖率下降時伴隨 cyclin Dl 的表達下調(diào)。Duman-Scheel 等[28]研究發(fā)現(xiàn) HH 信號能促進果蠅發(fā)育過程中 cyclin E 和 cyclin D 的轉(zhuǎn)錄，這兩種蛋白是細胞周期的主要調(diào)控因子，且 cyclin Dl 在軟骨細胞增殖時高表達，在軟骨細胞靜止時低表達，這些充分提示 IHH 通過介導 cyclin Dl 的表達參與調(diào)控軟骨細胞的增殖。

三、IHH-PTHrP 負反饋環(huán)

甲狀旁腺素相關蛋白 ( parathyroid hormone related protein，PTHrP ) 是 1987年在患有惡性高鈣血癥的患者中首次發(fā)現(xiàn)的[29]，它是甲狀旁腺素 ( PTH ) 家族的第 2個成員。PTHrP 分布范圍廣泛，在正常成人和胎兒體內(nèi)許多組織器官如肺、心、腎、骨、腦、皮膚、乳腺、胰島等均有所表達，發(fā)揮不同的生理作用。PTHrP 是自分泌或旁分泌的軟骨分化調(diào)節(jié)劑，能夠減少軟骨細胞分化和阻止程序性細胞死亡。Vortkamp 等[30]在 1996年首次證實 IHH 和PTHrP 之間存在負反饋調(diào)節(jié)機制，并借此控制胎兒長骨發(fā)育過程中軟骨細胞的增殖和分化過程。IHH 通過直接或間接的方式誘導關節(jié)周軟骨膜內(nèi)細胞合成 PTHrP，PTHrP 通過彌散作用與表達于增殖區(qū)和前肥大區(qū)軟骨細胞表面的受體 PPR 結(jié)合，抑制該區(qū)域軟骨細胞繼續(xù)向肥大軟骨細胞分化，通過將軟骨細胞阻滯在增殖狀態(tài)，減少前肥大軟骨細胞的數(shù)量，從而減少 IHH 的表達量。IHH 和 PTHrP 之間的負反饋環(huán)對于依賴軟骨內(nèi)成骨方式的長骨發(fā)育過程是極其重要的[31]，PTHrP 在增值區(qū)軟骨細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，故而 IHH 可在近距離直接調(diào)控軟骨細胞的增殖和分化。van Donkelaar 等[32]應用一維理論模型研究 IHHPTHrP 反饋環(huán)在骨骺生長板中的作用，認為 IHH、PTHrP蛋白在調(diào)控軟骨細胞增殖與分化中的作用是不等的，與IHH 相關的參數(shù)決定軟骨細胞增殖，與 PTHrP 相關的參數(shù)決定軟骨細胞肥大。而 Mak 等[8]對小鼠胚胎進行研究，觀察到在軟骨內(nèi)骨骼發(fā)育過程中，在沒有 PTHrP 的情況下，分別激活和滅活了 IHH 信號時發(fā)現(xiàn)體外用聲刺猬 ( SHH )蛋白處理 PTHrP - / - 肢體外植體或在 PTHrP - / - 軟骨中過度表達 IHH，可上調(diào)發(fā)育中軟骨的 IHH 信號，HH 信號的負調(diào)節(jié)因子促進 PTHrP - / - 胚胎軟骨細胞肥大。相反，當 HH 信號被環(huán)胺阻斷或 HH 信號的正調(diào)節(jié)因子 Smo阻斷時，PTHrP - / - 胚胎軟骨細胞肥大延遲。此外，在繼發(fā)性骨化過程中，出生后軟骨中的 HH 信號上調(diào)會導致軟骨細胞肥大的加速，進而導致關節(jié)軟骨的減少，故降低IHH 的活性具有軟骨保護效應，這也說明 IHH 信號在促進軟骨細胞肥大中具有獨立于 PTHrP 的作用[33]。

四、IHH 對 BMSCs 的誘導作用

BMSCs 是一類從骨髓中分離出來的具有強大增殖及分化能力的干細胞，在不同的誘導條件下可分化為成骨細胞、脂肪細胞、成軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等多種組織細胞[34]。BMSCs 的增殖及成骨分化能力直接關系到骨形成活性。Foxc2屬于轉(zhuǎn)錄因子 Forkhead 家族，參與間充質(zhì)組織分化過程[35]。Lin 等[36]將 BMSCs 分別在基礎培養(yǎng)基、柚皮苷基培養(yǎng)基、成骨誘導培養(yǎng)基，柚皮苷成骨誘導培養(yǎng)基，添入 IHH 抑制劑環(huán)巴胺的柚皮苷成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過 western blot 檢測 IHH 蛋白水平，發(fā)現(xiàn)通過 IHH 信號通路能上調(diào) Foxc2表達，誘導分化 BMSCs。Runx2是一種屬于 Runt 同源域蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與 MSCs 向成骨前體細胞分化的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控，其也被稱為成骨細胞特異性因子 2( OSF2)[37]。Oliveira 等[38]研究 HH激動劑 purmorphamine 在基因譜上對 HH 信號通路與成骨細胞分化的影響時發(fā)現(xiàn)，purmorphamine 激活 HH 通路并上調(diào)了 Runx2的表達，從而誘導 BMSCs 等分化。Liu 等[39]在體外構(gòu)建了兔 IHH 基因的腺病毒質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到兔 BMSCs 中，在模擬微重力環(huán)境下，IHH 轉(zhuǎn)染組在分化的各個階段表達高水平的軟骨相關因子以及低水平的軟骨肥大相關因子。因此認為 IHH 基因可誘導 BSMCs 分化，從而有效促進軟骨生成，抑制軟骨老化。

五、其它因子對 HH 信號的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄激活因子-4( Atf4) 是一種含亮氨酸支鏈的轉(zhuǎn)錄因子，通過激活軟骨細胞中的骨鈣素 ( osteocalcin，Ocn )和 IHH 發(fā)揮作用。Atf4在軟骨細胞和成骨細胞中對骨骼發(fā)育和骨形成的調(diào)控作用尚不清楚。Atf4最初被認為是一種具有成骨特異性的結(jié)核活性分子[40]，小鼠中缺失 Atf4會導致嚴重的骨質(zhì)減少、成骨細胞終端分化受損、骨鈣素表達降低及 I 型膠原合成減少[41]，隨后的研究表明 Atf4也在軟骨細胞中表達，通過轉(zhuǎn)錄激活 IHH 調(diào)控軟骨細胞在骨骼發(fā)育過程中的增殖和分化[42]。

Kif7是驅(qū)動蛋白 4超家族的一員，與腦積水、肢端一胼胝體綜合征等多種疾病相關，也參與了 HH-Gli 信號通路[43]。融合抑制因子 ( suppressor of fused，Sufu ) 常作為 HH 信號的負性調(diào)節(jié)因子[44]。Kif7通過 Sufu 促進 Gli 的活性，也可以通過非依賴 Sufu 抑制 Gli 的活性，Kif7與Sufu 的協(xié)同或拮抗作用通過影響 Gli 的活性而決定細胞的分化[45-46]。

六、IHH 與 OA 患者的軟骨代謝

大量研究在觀察動物 OA 模型或 OA 患者時，均可在血清、關節(jié)液或關節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn) IHH 表達的上調(diào)[6-7,11-12,47]。在正常的關節(jié)軟骨中，IHH 信號通路是不活躍的。缺乏IHH 信號時，其下游的膜受體、Gli 等轉(zhuǎn)錄因子處于抑制狀態(tài)。有學者認為，在 OA 軟骨中機械負荷、損傷、炎癥、遺傳和衰老相關因素導致 IHH 表達升高，從而導致其下游的 Gli 等轉(zhuǎn)錄水平提高，進而出現(xiàn) X 型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶 13( matrix metalloproteinase 13，MMP-13) 表達增加，最后導致軟骨變性[48]。Lin 等[49]觀察到在 OA 患者的軟骨中 IHH 信號下游的 Gli、Ptc、Hhip mRNA 水平上調(diào)，而通過沉默小鼠的 Smo 基因可以有效減輕 OA 的嚴重程度。Zhou 等[50]通過刪除小鼠軟骨中的 IHH 基因，減弱了小鼠 KOA 的進展，認為阻斷 IHH 基因可作為一種治療方法來預防以及延緩軟骨損傷的發(fā)生。Wei 等[51]發(fā)現(xiàn) OA患者軟骨和關節(jié)液中的 IHH mRNA 和蛋白水平提高的同時，X 型膠原和 MMP-13mRNA 和蛋白也存在上調(diào)。以上研究都揭示了 IHH 基因及其信號通路在 OA 患者關節(jié)軟骨損傷中的病理作用。

IHH 表達水平的提高，是否加速了 OA 的病程進展目前尚存在爭議。Sieker 等[52]將編碼 IHH 的腺病毒載體顆粒植入兔膝軟骨缺損處，觀察到了較高質(zhì)量的軟骨修復；Ang 等[53]敲除小鼠軟骨細胞中的 IHH 基因后發(fā)現(xiàn)，細胞生長被抑制而細胞凋亡增加。肢體長骨的常須依靠肢段軟骨內(nèi)成骨的方式，許多學者通過基因敲除后的小鼠觀察到[33,54]：IHH 基因敲除的小鼠軟骨細胞增殖下降，而且肢體短于空白對照組，這充分說明了 IHH 促進軟骨細胞增殖的作用。

總之，IHH 作為一種與軟骨高度相關的信號分子，在軟骨退變期間表達活躍，IHH 的含量增加會導致軟骨細胞向肥大細胞分化，也可能會促進軟骨細胞的增殖修復。大量研究證實 IHH 與關節(jié)軟骨的代謝高度相關，其主要調(diào)節(jié)機制包括 IHH-Gli 信號通路、IHH-PTHrP 負反饋環(huán)、對 BMSCs 的誘導作用等等，雖然目前對于其是否加速了OA 病程的進展仍存在爭議，但不可否認 IHH 或可成為未來診斷 OA 的重要生物標志物以及治療 OA 的潛在靶點。繼續(xù)對 IHH 與關節(jié)軟骨代謝的分子學機制作進一步研究，有望為治療 OA 提供一種可供應用于臨床的實驗室指標，為廣大 OA 患者的早期診斷、精準治療帶來福音。