基于Fe3O4/SiO2/Au-MNPs磁性SERS基底的特布他林超靈敏檢測

施 浩，陳 輝,2，張 政，孫 玉，張學(xué)典,2

（1.上海理工大學(xué) 光電信息與計算機工程學(xué)院，上海 200093；2.上海理工大學(xué) 上海市現(xiàn)代光學(xué)系統(tǒng)重點實驗室，上海 200093）

引 言

特布他林（terbutaline，TB）是一類結(jié)構(gòu)和功能都類似腎上腺素的苯乙胺類衍生物，近年來，不法商販將其添加于喂養(yǎng)動物的飼料中，以提高瘦肉率、改善料肉比，從中牟取暴利。但研究發(fā)現(xiàn)，動物源性食品中特布他林的殘留可對人體產(chǎn)生極大傷害，食用含有瘦肉精的豬肉很容易引起中毒，重者出現(xiàn)心慌、肌肉震顫、頭疼、神經(jīng)過敏等癥狀，輕者無明顯感覺，但長期食用可致“慢性中毒”，引起染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤。因此歐盟、中國等國家禁止在畜禽生產(chǎn)上使用TB。

目前，TB檢測主要采用的方法有高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和酶聯(lián)免疫法等。色譜法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點，但樣品前處理過程繁瑣，檢測速度慢，不適于現(xiàn)場大量篩選。酶聯(lián)免疫法作為一種快速篩選藥物殘留的方法，具有操作簡便、樣品容量大、儀器化程度高和分析成本低的特點，但是酶聯(lián)免疫法的影響因素多，易出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果。因此建立快速、簡便、高效的檢測TB的方法一直是食品安全研究領(lǐng)域的熱點。

表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）是納米尺度上的特殊表面增強光學(xué)現(xiàn)象，由于其獨特的指紋光譜特性、非破壞性的快速檢測和高靈敏度，成為了一種實用的化學(xué)和生物分子傳感與識別分析工具。SERS通常采用表面粗糙的納米金屬材料（如金、銀等）作為基底，金屬結(jié)構(gòu)表面的局域等離激元可以有效地將吸附在基底表面的待分析物分子的拉曼散射信號增強104～1015倍。為進(jìn)一步提高SERS檢測靈敏度，研究人員開發(fā)了不同形貌的金屬納米結(jié)構(gòu)的制備方法[1]，包括球形、三角形片及納米棒等，但是納米尺寸的金屬顆粒的表面能較高，容易聚集，因此穩(wěn)定性較差[2]。例如， Izquierdo-Lorenzo等就是使用金納米顆粒作為基底對TB進(jìn)行檢測，但是金納米粒子穩(wěn)定性較差，因此其檢測效果有待提高[3]。為了實現(xiàn)更高靈敏度的TB檢測，開發(fā)基于AuNPs的納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，改善金納米粒子的性能是必要的。迄今為止，各種材料，包括金屬有機框架（MOFS）[4-5]、硅納米線（SiNws）、Pbs、Ag、Pd、SiO2和 Fe3O4已被用于構(gòu)建功能性AuNPs基納米復(fù)合材料。其中，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒與貴金屬（Au，Ag）的結(jié)合將更利于增強SERS強度，這是因為磁聚集會引起光學(xué)熱點，熱點內(nèi)的電磁耦合作用會導(dǎo)致電磁場強度增強。例如：Cai等已制備的Fe3O4/C/Au-to-SERS，在外磁場作用下，可以產(chǎn)生更多光學(xué)熱點來催化反應(yīng)[6]；Zhang等制備的Fe3O4/TiO2/AuNPs核殼微球具有出色的SERS活性[7]。另一方面，SiO2具有良好的親水性、生物相容性，同時表面易于進(jìn)行功能化，可以用來提高AuNPs在鹽溶液中的穩(wěn)定性[8-10]。同時SiO2作為Fe3O4納米粒子包裹層，可以保護(hù)Fe3O4，增強Fe3O4納米粒子在復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性，還為后續(xù)的功能化提供更多可能。因此，本文采用Fe3O4/SiO2/Au-MNPs核殼微球?qū)B進(jìn)行了無標(biāo)痕量檢測。

本文以磁性納米球為核，并包覆上SiO2薄層，然后通過靜電作用在SiO2表面均勻密集地吸附金納米粒子，最終得到同時具有磁性和SERS活性的衛(wèi)星狀的納米核殼結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有更好的電磁耦合作用，可以在金納米粒子之間形成大量熱點，從而使表面獲得更好的SERS增強作用。

1 實驗部分

1.1 結(jié)構(gòu)設(shè)計

本研究采用Fe3O4/SiO2/Au-MNPs核殼結(jié)構(gòu)對TB進(jìn)行檢測。圖1為探針制備流程圖，圖2為TB檢測流程圖。

首先，以粒徑為150 nm的Fe3O4磁性納米顆粒（Fe3O4MNPs）為內(nèi)核，在乙醇介質(zhì)中用氨催化水解四乙氧基硅烷（TEOS），從而在Fe3O4表面包裹一層薄薄的SiO2層，形成Fe3O4/SiO2磁性納米粒子（MNPs）；然后，利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），對Fe3O4/SiO2磁性納米粒子（MNPs）表面進(jìn)行氨基化修飾，使其表面帶正電；最后，帶負(fù)電的粒徑為15 nm的金納米粒子（AuNPs）通過與-NH2之間的靜電相互作用組裝到Fe3O4/SiO2的表面，形成衛(wèi)星狀核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs。此過程有效地解決了Fe3O4與貴金屬之間不相容、成鍵難的問題，使金納米顆粒的包覆更為容易。得到的磁性SERS納米基底用于檢測TB，TB通過氨基與金納米粒子之間的作用結(jié)合到Fe3O4/SiO2/Au-MNPs表面，在外加磁場作用下，結(jié)合有TB的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs發(fā)生聚集，溶液中的TB被磁性分離和富集出來，然后使用拉曼光譜儀檢測基底表面TB的SERS信號。

1.2 材料與儀器

檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O，99%）、三水合氯金酸（HAuCl4·3H2O，99%）、納米四氧化三鐵（99.5%）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，99%）、硅酸四乙酯（TEOS，98%）、氨水（NH3·H2O）、無水乙醇（C2H6O）均購于麥克林，特布他林半硫酸鹽（C12H19NO3·1/2H2SO4，阿拉?。?、實驗使用去離子水（18.25 MΩ·cm）通過億利實驗室超純水機（YL-100，深圳市億利源水處理設(shè)備有限公司，中國）制備，SHA-B數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠）、pH-103筆式酸度計（pH-103，常州愛德克斯儀器儀表有限公司，上海）。

圖1 探針制備流程圖Fig. 1 Flow chart of nanosensors preparation

圖2 Terbutaline檢測流程圖Fig. 2 Flow chart of Terbutaline detection

1.3 AuNPs的制備

金納米粒子通過檸檬酸鈉還原三水合氯金酸的制備方法得到[11]，即利用檸檬酸鈉作為還原劑制備金納米粒子。首先在250 mL燒杯中加入100 mL去離子水并勻速攪拌；然后加入370 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯金酸溶液持續(xù)攪拌，將其加熱至沸騰后，繼續(xù)加入10 mL 38.8 mmol/L的二水合檸檬酸鈉溶液，溶液逐漸變成酒紅色，保持沸騰30 min；最后冷卻至室溫，隔夜備用。

1.4 Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的制備

將1 mg Fe3O4MNPs溶于5 mL無水乙醇中，超聲分散后，再加入0.3 mL的氨水和30 μL的TEOS溶液并繼續(xù)超聲5 min，待溶液均勻分散后，將混合液放入恒溫水浴震蕩器中震蕩18 h（轉(zhuǎn)速為200 r/min）。震蕩完成后，利用磁性將納米粒子分離出來，并用乙醇清洗及重新分散至5 mL。隨后加入540 μL APTES溶液繼續(xù)震蕩8 h（轉(zhuǎn)速為200 r/min），合成出均一的、單分散并帶有氨基修飾的Fe3O4/SiO2-NH2納米顆粒。震蕩完成后，用磁性分離的方法將磁性納米粒子吸出，并用乙醇清洗，然后加入6 mL已制備的金種子，并繼續(xù)震蕩21 h（轉(zhuǎn)速為200 r/min）。震蕩完成后，用磁性將納米粒子分離出來，并用乙醇清洗及分散至6 mL。

1.5 Fe3O4/SiO2/Au/TB-MNPs的制備

將 TB 稀釋成 1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L 的溶液。分別取100 μL已制成的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs溶液分別加入 100 μL 不同濃度（1×10-4mol/L、1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）的TB中，配成終濃度分別為5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L、5×10-9mol/L的溶液。隨后放入恒溫水浴震蕩器中震蕩21 h（轉(zhuǎn)速為200 r/min）。震蕩完成后，用磁性分離的方法分別將這些溶液中的納米粒子吸出，然后用去離子水稀釋至60 μL。由文獻(xiàn)[3]可知，在酸性環(huán)境下對TB檢測效果較好，故將稀釋出溶液的pH調(diào)為5.5。

1.6 SERS檢測

首先，取濃度 5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L、5×10-9mol/L 的待測液各5 μL，并分別滴加在玻片上晾干；然后，使用共聚焦拉曼光譜儀（XploRA Plus，HORIBA Scientific）對樣本進(jìn)行拉曼測試。檢測時，激光光源功率為10 mW、波長為638 nm，顯微物鏡的放大率為10倍，圖像拍攝的曝光時間為4 s，曝光次數(shù)為2次，狹縫寬度30 μm，光譜采集范圍為300～1 800 cm-1。用UV-3600分光光度計檢測AuNPs和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的消光光譜。采用透射電鏡（JEM-2100F，JEOL電子顯微，200 kV）對 Au、Fe3O4、Fe3O4/SiO2和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的形貌進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的表征

Fe3O4/SiO2/Au-MNPs由Fe3O4磁芯、SiO2殼層和AuNPs吸附層組成。SiO2殼層作為中間層將磁核和AuNPs組裝起來，AuNPs分布在SiO2殼層表面，得到核殼性的納米微型結(jié)構(gòu)，同時具有優(yōu)異的超順磁以及SERS光學(xué)活性。利用透射電鏡（TEM）對納米顆粒的大小和形貌進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖3所示。圖3（a）為使用經(jīng)典檸檬酸鈉還原法合成的AuNPs，其平均大小為13 nm。圖3（b）為呈球形的Fe3O4磁核，分散較好，粒徑大約為150 nm，且在Fe3O4磁核表面包裹一層SiO2。圖3（c）為呈球狀的Fe3O4/SiO2納米粒子，且SiO2與Fe3O4中有很明顯分界，表明SiO2已成功地包覆在Fe3O4納米粒子的表面。由于檸檬酸鈉還原的金納米粒子表面帶負(fù)電，通過靜電吸附作用，金納米粒子可以吸附到Fe3O4/SiO2表面，最終形成納米衛(wèi)星狀的Fe3O4/SiO2MNPs，如圖 3（d）所示，F(xiàn)e3O4/SiO2MNPs的周圍均勻地附著了大量的AuNPs。

圖3 Au，F(xiàn)e3O4 MNPs，F(xiàn)e3O4/SiO2和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的TEM圖Fig. 3 TEM Images of Au, Fe3O4 MNPs, Fe3O4/SiO2 and Fe3O4/SiO2/Au-MNPs

圖4 Au以及在APTES的不同用量下制備的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs探針的消光光譜Fig. 4 Extinction spectra of Au and Fe3O4/SiO2/Au-MNPs at different quantities of APTES

AuNPs和Fe3O4/SiO2/Au-MNPs的消光光譜如圖4所示，AuNPs在520 nm波長處有明顯的吸收峰，這是由于AuNPs的表面等離子體共振吸收導(dǎo)致的[12]。當(dāng)Fe3O4/SiO2表面吸附AuNPs后，在650 nm處可以觀察到一個較寬的峰，與AuNPs相比，特征峰發(fā)生了明顯的紅移，這是由于金納米粒子在Fe3O4/SiO2MNPs表面發(fā)生了一定的聚集[13]，表明AuNPs已經(jīng)成功裝載到Fe3O4/SiO2的表面[14]。此外，通過改變APTES的用量（如分別采用 180 μL、360 μL、540 μL）對Fe3O4/SiO2表面進(jìn)行不同程度的氨基化修飾，從而改變Fe3O4/SiO2表面吸附的金屬納米粒子密度，對吸附的金納米粒子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。由圖4可知，使用540 μL APTES做出的Fe3O4/SiO2/Au-MNPs效果最佳（因為其消光譜強度最強），故后續(xù)實驗都保持該用量。

2.2 TB的SERS特性

完成基底的制備和表征后，我們利用該基底對TB進(jìn)行定量檢測。分別對5×10-5～5×10-9mol/L濃度梯度下的TB進(jìn)行SERS檢測。在每個濃度下，隨機選取15個點進(jìn)行檢測，平均光譜即為該濃度下TB的拉曼信號，如圖5所示。光譜圖上的特征峰峰位與 Ali等檢測的TB峰位相一致[15]，如表1所示，具體體現(xiàn)在1 600 cm-1是C＝C的拉伸帶，1 034 cm-1是C-OH的呼吸帶，780 cm-1是C-H的搖擺振動帶，400 cm-1是CCC的變形帶。這些特征峰表明本實驗的檢測物為TB。同時，圖5顯示了不同濃度下TB的SERS光譜圖。可以看出，隨著TB濃度的降低，其特征峰值的強度也隨之逐漸減小，且拉曼光譜特征保持著一定的完整性。

圖5 TB 在不同濃度下 (5×10-5 ～5×10-9 mol/L）的拉曼光譜圖Fig. 5 The Raman spectra of TB at different concentrations(5×10-5 -5×10-9 mol/L).

表1 特布他林的基礎(chǔ)共振波數(shù)Tab. 1 The fundamental vibrational wavenumbers of terbutaline

因此，以TB在1 034 cm-1處拉曼峰的信號強度為縱坐標(biāo)、TB濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制其校準(zhǔn)曲線，如圖6所示（進(jìn)行歸一化處理），再利用最小二乘法計算出校準(zhǔn)曲線，得到

曲線的R2=0.996。結(jié)果顯示，在5×10-5～5×10-9mol/L范圍內(nèi)TB的SERS信號強度相對于濃度梯度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。根據(jù)3-sigma規(guī)則計算最低檢測限[16]（噪聲取自850～950 cm-1波段），具體計算式如下：

圖6 在1 034 cm-1處TB濃度對數(shù)與拉曼強度的線性關(guān)系圖Fig. 6 Linear plot of intensity of the 1 034 cm-1 peak for various concentrations of TB

式中：Yb為噪聲信號的平均值46.2；σ為噪聲信號的標(biāo)準(zhǔn)差18.4；A為校準(zhǔn)曲線的截距；k為校準(zhǔn)曲線的斜率。利用式（2）計算出LOD為3.77×10-10mol，表2為特布他林曲線擬合結(jié)果。

表2 特布他林線性擬合結(jié)果Tab. 2 Linear fitting results of terbutaline

3 結(jié) 論

本文提出一種利用磁性SERS基底快速富集和檢測TB的方法。該基底以磁性納米球為核，在表面附著上SiO2薄層，并將金納米粒子密集地組裝在SiO2表面上，最終形成一種納米衛(wèi)星狀的核殼結(jié)構(gòu)。由于最外層組裝的金納米粒子比較密集，相鄰粒子之間有強烈的電磁耦合作用，在金納米粒子之間形成大量熱點，因此該基底具有優(yōu)異的SERS活性。同時該基底還集成了優(yōu)異的磁性分離功能，可對待測分子進(jìn)行快速富集，進(jìn)一步增強待測分子的SERS信號。該方法具有前處理簡單、檢測靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點。本文多層組裝納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的合成方法也為其他多功能復(fù)合材料的制備提供了參考。