識別元件在糧食真菌毒素檢測中應用的研究進展

韓逸陶，李可敬，羅 菲，黎 睿，李春花，謝 剛

質(zhì)量安全

識別元件在糧食真菌毒素檢測中應用的研究進展

韓逸陶，李可敬，羅 菲，黎 睿，李春花，謝 剛

（國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

真菌毒素是造成糧食污染的重要因素之一，是全球糧食安全領域研究的焦點與熱點，發(fā)展快速、精準、低廉、方便的真菌毒素檢測技術對保障糧食安全具有重要意義?；谏飩鞲蟹治龅恼婢舅貦z測技術，識別元件的特異性和選擇性至關重要，是良好分析性能的先決條件。系統(tǒng)梳理近年來主要識別元件類型，對基于識別元件的生物傳感分析技術在真菌毒素檢測中的應用與現(xiàn)階段存在的問題進行分析和綜述，并展望其在真菌毒素分析領域的發(fā)展趨勢，以期為真菌毒素檢測相關研究和安全監(jiān)管提供參考和啟發(fā)。

真菌毒素；糧食；識別元件；生物傳感；研究進展

糧食是關系國計民生的重要戰(zhàn)略物資。真菌毒素[1]是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，在糧食生產(chǎn)、儲存、加工和流通等環(huán)節(jié)廣泛存在，具有污染廣、種類多、危害重、毒性強等特點[2-3]。據(jù)中國工程院權威發(fā)布的《中國食品安全現(xiàn)狀、問題及對策戰(zhàn)略研究》統(tǒng)計，我國每年被真菌毒素污染的糧食有3 100多萬噸，約占年總產(chǎn)量的6.2%，損失約達850多億元。在迄今發(fā)現(xiàn)的400多種真菌毒素[2]中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、伏馬毒素和T-2毒素是我國糧食污染較為嚴重的真菌毒素種類。通過研究發(fā)現(xiàn)，真菌毒素主要通過被污染的糧食和受污染飼料喂養(yǎng)的動物所提供的動物性食品進入人類食物鏈，對人畜產(chǎn)生遺傳毒性、細胞毒性、免疫毒性和致腫瘤毒性[3]。近年來，由真菌毒素引起的糧食安全問題日益引起世界各國的高度關注，包括我國[4]在內(nèi)有超過100個國家對糧食中的真菌毒素制定了限量標準，同時聯(lián)合國食品添加劑專家委員會也規(guī)定了人體對各種真菌毒素及其衍生物的每日最大耐受攝入量。因此發(fā)展準確、快速、高效的糧食真菌毒素檢測技術尤為重要。

本文通過對糧食真菌毒素的不同檢測技術進行分析，介紹了基于目標識別-信號轉(zhuǎn)換的生物傳感分析法，重點對近年來報道的不同種類識別元件及在其基礎上建立的生物傳感檢測技術進行綜述，系統(tǒng)梳理其在糧食真菌毒素檢測的應用進展情況，為糧食真菌毒素檢測領域的發(fā)展提供一定參考。

1 糧食真菌毒素檢測技術

目前人們已經(jīng)掌握了多種分析技術對糧食真菌毒素進行檢測。根據(jù)不同的分析原理，有通過待測目標物或樣品固有性質(zhì)進行分析的，主要包括儀器分析法、無損檢測法，有通過引入識別分子經(jīng)與目標物作用后產(chǎn)生信號而進行分析的，最具代表的為生物傳感分析法。

1.1 儀器分析法

儀器分析法[5-6]是通過真菌毒素在固定相與流動相間分配系數(shù)的差異而進行的分離分析方法，在我國糧食真菌毒素的檢測中應用最為廣泛。較早出現(xiàn)的為薄層色譜法，目前主要有液相色譜法、氣相色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。儀器分析法是一種有效的確證方法，具有準確度高、定量限低等優(yōu)點。但該方法的樣品前處理復雜，對操作人員技術要求高，儀器設備昂貴，且目標物多限定在對紫外吸收或熒光有響應的真菌毒素種類。鑒于谷物等糧食檢測具有日常檢樣量大、數(shù)據(jù)實時性高等特點，常規(guī)儀器分析法難以滿足短時間、大量樣品現(xiàn)場測定的需求。

1.2 無損檢測法

無損檢測技術[7]是在不破壞樣品的情況下，利用樣品內(nèi)部結(jié)構異?；蛉毕菟鸬墓狻⒙?、電、熱、磁等反應的變化，結(jié)合現(xiàn)代信息處理技術而進行的檢測，主要包括近紅外光譜法、高光譜圖像法、電子鼻等。由于無損檢測技術利用化學計量學建立檢測對象的相關關系，因此檢測結(jié)果及精度易受樣品狀態(tài)和待測物含量等因素影響，檢測機制有待進一步分析與驗證，目前多作為真菌毒素定性篩查的方法，定量檢測的研究還不成熟，限制其在糧食檢測中的應用。

1.3 生物傳感分析法

生物傳感分析[8-9]是通過引入識別分子，經(jīng)與目標物作用后產(chǎn)生信號進行分析，兩個過程必不可少。其一是目標物的識別過程，即待測物真菌毒素與生物活性分子發(fā)生生物化學反應進而特異性結(jié)合的過程，通過敏感識別元件實現(xiàn)；其二是信號的輸出過程，即將真菌毒素-識別元件共同產(chǎn)生的生物學信號轉(zhuǎn)化或放大為可定性/定量檢測的光、電、磁、聲、熱等信號，通過信號轉(zhuǎn)換放大元件實現(xiàn)。生物傳感技術因分析速度快、選擇性高、成本低且操作簡便，易實現(xiàn)在線篩查與定量監(jiān)測大量樣本，目前已廣泛應用于食品檢測領域[8-9]。生物傳感過程中識別元件的特異性和選擇性至關重要，是關系檢測結(jié)果準確性、靈敏度、檢測限、穩(wěn)定性等多項傳感性能指標的先決條件。

2 識別元件在糧食真菌毒素檢測中的研究進展

根據(jù)目前糧食中真菌毒素檢測的研究與應用，常用的識別元件大致可分為免疫抗體、分子印跡、核酸適配體、多肽等四類。

2.1 免疫抗體

在上述識別元件中，應用最為廣泛的就是免疫抗體。免疫分析法[10-11]是利用抗體與抗原或半抗原之間的選擇性反應而建立的，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法技術、膠體金免疫層析技術、熒光免疫分析技術時間分辨熒光免疫分析技術以及其他光學免疫分析技術和電化學免疫分析技術等。免疫分析法具有特異性強、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)勢，目前我國糧食真菌毒素快檢市場相繼涌現(xiàn)了酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、膠體金快速檢測卡和熒光/時間分辨熒光免疫檢測卡等產(chǎn)品[7]。由于酶聯(lián)免疫吸附試劑盒需要制作標準曲線并使用酶標儀，對實驗環(huán)境和人員要求較高、耗時較長，正逐漸被基于膠體金和熒光/時間分辨熒光材料的免疫速測產(chǎn)品替代[11]，相關產(chǎn)品可實現(xiàn)糧食中真菌毒素的定量/半定量分析以及多種真菌毒素的同時篩查。

免疫分析法及產(chǎn)品雖然展現(xiàn)了巨大的應用潛力，但其在實際研究及應用過程中仍具有一定局限性：（1）依賴于活體免疫過程篩選的抗體，耗時長、價格高；（2）不同批次獲得的抗體難以保證高質(zhì)和穩(wěn)定的親和性能；（3）酶與抗體的化學結(jié)合可能導致產(chǎn)生不穩(wěn)定的隨機交聯(lián)分子，存在假性結(jié)果的風險。為了克服上述問題，研究人員從基因工程抗體改造入手，將篩選對象從重組抗體片段的抗原結(jié)合片段和單鏈可變片段擴展為單克隆抗體[12]。單克隆抗體也被稱為納米抗體，是由單個單體可變抗體結(jié)構域組成的抗體片段，相比抗原結(jié)合片段和單鏈可變片段，納米抗體具有更高的穩(wěn)定性、特異性和溶解性，易于基因編輯，重折疊能力更強。TANG X Q等[13]利用納米抗體設計競爭型壓力依賴的免疫傳感器，成功用于小麥中鐮刀菌烯醇類真菌毒素的檢測。TANG Z W等[14]通過納米抗體-堿性磷酸酶融合蛋白技術，開發(fā)了一種基于聚偏氟乙烯膜的斑點免疫測定法，對谷物中的真菌毒素實現(xiàn)了一步可視化檢測。PAN D等[15]基于納米抗體和碳納米材料，建立了一種便捷、靈敏的電化學直接免疫分析方法，用于小麥中黃曲霉毒素B1的檢測。盡管納米抗體具有克服傳統(tǒng)抗體的潛在優(yōu)勢，但篩選獲得高質(zhì)量納米抗體仍是當前的技術挑戰(zhàn)，制約了其在真菌毒素檢測中的廣泛應用。

2.2 分子印跡

分子印跡技術[12,16]是指以目標分子或其結(jié)構類似物為模板分子，經(jīng)共價或非共價鍵與功能單體預組裝后，通過聚合反應在模板分子周圍形成高度交聯(lián)的三維網(wǎng)狀聚合物的技術。分子印跡聚合物具有構效可設計性、專一識別性和高穩(wěn)定性等特點。目前，在糧食真菌毒素分析方面，分子印跡技術多應用于樣品前處理中，有望取代傳統(tǒng)的免疫親和柱，在實現(xiàn)特異性分離、凈化和富集的同時，還可降低樣品前處理成本和操作條件要求。1994年SELLERGREN B等[16]首次將分子印跡材料應用于固相萃取，奠定了分子印跡固相萃取技術發(fā)展的基礎。到目前為止，分子印跡技術被發(fā)展為分子印跡固相萃取、分子印跡微固相萃取、磁分子印跡固相萃取和分子印跡攪拌棒吸附萃取等多種技術方法[17]。YANG Y K等[18]采用溶膠-凝膠法在硅球表面聚合制備了展青霉素核殼型分子印跡微球，并以此建立了基于在線分子印跡固相萃取柱的液相色譜檢測方法。DIAZ-BAO M等[19]建立了一種簡便、快速的分子印跡整體柱攪拌棒制備方法，即在分子印跡本體聚合體系中直接添加四氧化三鐵顆粒后再進行聚合，無需使用現(xiàn)成攪拌子，該聚合材料可用于萃取嬰幼兒配方奶粉及谷物食品中的黃曲霉毒素。

此外，分子印跡技術還被廣泛用于真菌毒素傳感檢測領域[12,17]，包括電化學、光學及壓電等多種信號輸出形式的傳感器。研究表明，在制備分子印跡聚合物時引入納米材料，可顯著提升其結(jié)合能力和動力學效能[20-22]。JIANG M J等[20]將金納米顆粒與對氨基苯硫酚通過電聚合，在金電極表面形成分子印跡-金屬框架膜，進而建立用于檢測黃曲霉毒素B1的分子印跡電化學傳感器。MAO L B等[21]利用石墨烯氧化物-硫化鎘量子點復合物制備分子印跡材料，設計了光電化學傳感器用于玉米中伏馬毒素B1的檢測。GU Y等[22]利用金納米顆粒摻雜分子印跡層與共價有機骨架形成的復合物，建立了一種用于檢測稻谷和小麥中黃曲霉毒素B1的石英晶體微天平。

目前可商用的真菌毒素分子印跡產(chǎn)品仍然有限[17]，主要由于以下三個原因：（1）多數(shù)分子印跡聚合物的選擇性和結(jié)合親和力仍普遍較低，未來需要開發(fā)更多可提高材料與真菌毒素特異性的分子印跡制備方法；（2）在真菌毒素樣品前處理方面，分子印跡聚合物普遍采用本體聚合的方法進行合成，較少結(jié)合基于納米材料和表面材料的分子印跡制備方法；尚未出現(xiàn)針對水溶性真菌毒素的水相容性分子印跡材料的合成及應用；吸附效率高且操作簡單的磁分子印跡固相萃取法和在線分子印跡固相萃取法應用較少。（3）在傳感設計方面，需靈活應用納米技術及表面化學，通過減小分子印跡殼層厚度，將納米材料及多孔結(jié)構材料應用于分子印跡層與電極表面之間的結(jié)構設計，以及使用比率熒光法定量等方法，進一步提高方法靈敏度與穩(wěn)定性。

2.3 核酸適配體

核酸適配體[23]是通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術從寡核苷酸序列庫中篩選獲得的對靶物質(zhì)具有高親和力的單鏈寡核苷酸片段。作為一類新型識別元件，核酸適配體與靶標物的相互誘導適應性識別作用，既依賴于靶分子與適配體空間結(jié)構的匹配性，又需要氫鍵、靜電吸引等多種作用力，該機制使得其辨別分子結(jié)構的能力達到原子水平[24]。與傳統(tǒng)天然抗體相比，這種特殊的“化學抗體”具有篩選條件溫和、批間差異小、親和力高、制備簡單、費用低等優(yōu)勢，尤其適于分離結(jié)構相似或易產(chǎn)生交叉反應的物質(zhì)。

自從2008年CRUZ-AGUADO J A等[25]首次篩選得到赭曲霉毒素A的適配體，到目前為止已篩選獲得了多種真菌毒素對應的核酸適配體[26]，并廣泛用于真菌毒素的檢測分析[24,27]。適配體具有良好的生物相容性，可與金屬納米材料、石墨類材料、上轉(zhuǎn)換材料以及磁性納米材料等先進功能材料發(fā)生結(jié)合或修飾[9]，這種特性有助于適配體的固定化，進而實現(xiàn)信號放大，顯著提升生物傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性等分析性能。WANG F Y等[28]利用上轉(zhuǎn)換納米材料與金納米顆粒產(chǎn)生的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，構建了基于單粒子檢測的黃曲霉毒素B1生物傳感器。GE J J等[29]通過在自組裝的脫氧核糖核酸納米管上引入不同配體，設計了電化學和電化學發(fā)光兩種傳感器用于定量分析黃曲霉毒素B1。

核酸適配體的靈活性和自由性，使其可在芳香環(huán)的堆疊、靜電、范德華力和氫鍵等的作用下，折疊形成如假結(jié)、發(fā)卡、鳥嘌呤四聚體、凸環(huán)等三維空間結(jié)構來識別和結(jié)合目標真菌毒素，同時還易于集成到多種不同形式的信號轉(zhuǎn)換元件 中[9,24]。根據(jù)信號輸出方式的不同，可分為比色適配體傳感器、熒光適配體傳感器、電化學適配體傳感器、電化學發(fā)光適配體傳感器以及表面增強拉曼適配體傳感器等。SEOK Y等[30]基于脫氧核酶-血紅素/適配體復合物開發(fā)了黃曲霉毒素B1誘導脫氧核酶結(jié)構變化的比色傳感器；ZHANG J等[31]采用脫氧核糖核酸支架-銀納米簇復合物，利用核酸雜交作用和鳥嘌呤四聚體結(jié)構，建立熒光適配體傳感器用于赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的同時檢測，該方法在小麥、稻谷和玉米等多種糧食作物的添加回收實驗中展現(xiàn)了良好的性能；JALALIANA S H等[32]基于適配體發(fā)卡結(jié)構、金納米顆粒以及核酸的雜交作用，開發(fā)了黃曲霉毒素M1的電化學傳感器；LI A K等[33]設計了基于金納米星與核-銀納米粒子復合材料的表面增強拉曼傳感器，用于檢測黃曲霉毒素B1。

目前基于適配體的真菌毒素檢測技術在實際應用中還面臨著一定瓶頸：（1）真菌毒素的適配體種類單一，局限于曲霉和鐮刀菌屬等少數(shù)真菌毒素類型，亟需補充真菌毒素適配體種類；（2）已獲得的真菌毒素適配體特異性和穩(wěn)定性較差，需提升適配體的篩選效率與適用性；（3）實際糧食樣品基質(zhì)復雜，給檢測的高精準性帶來一定難度，需要開發(fā)針對性強、實用性高的適配體前處理技術。

2.4 多肽

多肽是天然或合成的氨基酸聚合短鏈，通過肽鍵連接在一起，其與蛋白質(zhì)具有相同的化學結(jié)構和性質(zhì)，具有穩(wěn)定性高、易修飾、化學通用性強等特點。多肽可替代抗體和簡單的生物受體與小分子結(jié)合，提高生物傳感器的分析性能。借助計算建模程序，可獲得不同真菌毒素的特定多肽配體[12]。從第二代肽庫中構建的噬菌體展示多肽，具有更高的結(jié)合親和力。利用噬菌體展示技術[34]來篩選真菌毒素模擬表位, 模擬肽可用于替代真菌毒素建立無毒無害的分析方法。WANG Y R等[35]從噬菌體隨機八肽庫中，用抗黃曲霉毒素抗體為配體，逐輪減少抗體包被濃度，最終淘篩出五個表位模擬肽，用于替代真菌毒素，建立免疫吸附反應檢測總黃曲霉毒素含量。HE Q H等[36]用抗玉米赤霉烯酮抗體從噬菌體隨機七肽庫中，經(jīng)三輪淘篩得到兩個替代玉米赤霉烯酮的模擬肽序列。除了噬菌體展示多肽，化學合成的短肽也同樣具有特異性結(jié)合真菌毒素的能力。TRIA S A等[37]和THYPARAMBIL A A等[38]利用含12個氨基酸的短肽構建了多種檢測赭曲霉毒素A的光學和電化學傳感器。然而，由于對多肽識別真菌毒素中所涉及的相互作用了解有限，設計具有高親和性的新型多肽受體仍具有挑戰(zhàn)，因此目前僅有少數(shù)多肽序列被成功用作真菌毒素的識別元件。

3 識別元件在糧食真菌毒素檢測中發(fā)展的前景與展望

本綜述重點介紹了近幾年不同識別元件在糧食真菌毒素檢測方面的研究進展，特異性強、穩(wěn)定性高的識別元件對提升檢測性能至關重要。相比傳統(tǒng)儀器分析方法，基于識別元件的真菌毒素生物傳感檢測技術更加適用于糧食收儲和監(jiān)管現(xiàn)場的快速、高效、方便、低廉的檢測需求，但在實際應用中，仍面臨諸多挑戰(zhàn)：（1）文中介紹的四類識別元件，除免疫抗體外，其他元件多處于實驗室研究階段，鮮有相應的成熟市售產(chǎn)品，亟待擴充實用化識別元件的種類，開發(fā)小型便攜式產(chǎn)品用于糧食安全監(jiān)測；（2）糧食真菌毒素檢測的準確性和穩(wěn)定性最為重要，應大力提升識別元件的篩選和制備技術，克服交叉反應和假性結(jié)果，獲得高特異性與高選擇性的識別分子，建立更加多元化的真菌毒素識別元件庫；（3）針對不同識別元件的特點，建立針對性強的前處理方法，消除基質(zhì)效應的非特異性吸附干擾，以適用于不同糧食種類的檢測；（4）目前已報道的真菌毒素識別元件對象單一，少有可檢測多目標物的元件類型，需著力研發(fā)同時檢測多種真菌毒素的識別元件；（5）對于基于識別元件的真菌毒素成熟檢測產(chǎn)品，目前我國仍缺乏公正、客觀、統(tǒng)一的評價方法和標準，同時還應建立科學的評價體系與機制，以促進糧食真菌毒素檢測行業(yè)有序發(fā)展。

現(xiàn)有常規(guī)分析方法已無法滿足糧食及其制品在生產(chǎn)、存儲、加工和流通各環(huán)節(jié)的對真菌毒素污染的高效檢測和安全監(jiān)管要求，快速、簡單、高效、便攜必將成為糧食真菌毒素檢測的趨勢，基于識別元件的生物傳感分析技術在其中扮演了重要的角色，其發(fā)展與應用無疑將對我國糧食安全與質(zhì)量控制產(chǎn)生重要影響。在未來的真菌毒素檢測研究中，期望發(fā)掘和開發(fā)出更多新的識別元件、檢測方法以及相關產(chǎn)品與設備，提高檢測 的準確性和時效性，開辟糧食真菌毒素檢測的新領域。

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Research advances in the application of recognition elements in the detection of mycotoxins in grains

HAN Yi-tao, LI Ke-jing, LUO Fei, LI Rui, LI Chun-hua, XIE Gang

(Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China)

Mycotoxin contamination is one of the key elements arousing grain safety problems and challenges, which are thus the increasingly focus- and hot-spot research area at global level. Hence, the development of fast-time, high-accuracy, low-cost, and simple-operation detection methods for monitoring mycotoxin is critical to the guarantee of grains afety and quality. During the whole process of biosensor, specificity and selectivity of recognition elements is prerequisite for the excellent analytical performance. This paper summarized the forms of major recognition elements reported in previous publications in the last few years, and reviewed the application of biosensors based on recognition elements in monitoring mycotoxins, and the main problems existing in this researching stage were also proposed, which could provide novel ideas and new sights into the development of related studies.

mycotoxins; grain; recognition element; biosensing; research advance

TS207.3

A

1007-7561(2020)03-0112-06

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.017

2020-02-15

“十三五”國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1602703和2019YFC1606600）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（ZX1919）

韓逸陶，1987年出生，女，博士，助理研究員，研究方向為糧食質(zhì)量安全檢測.

謝剛，1974年出生，男，博士，研究員，研究方向為糧食質(zhì)量安全.

（組稿：林家永）