富含不飽和脂肪酸蛋黃磷脂酰膽堿的提取與分子結(jié)構(gòu)分析

朱 帥，黃夢(mèng)玲，樊 俐，楊瑞鵬，張 敏，劉 云

專題報(bào)道（一）

富含不飽和脂肪酸蛋黃磷脂酰膽堿的提取與分子結(jié)構(gòu)分析

朱 帥1，黃夢(mèng)玲1，樊 俐1，楊瑞鵬2，張 敏2，劉 云1

（1. 北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；2. 蜜兒樂(lè)兒乳業(yè)（上海）有限公司，上海 200335）

磷脂酰膽堿（PC）是雞蛋蛋黃中的主要活性因子，為人體提供營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)。采用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取富含不飽和脂肪酸蛋黃PC工藝參數(shù)，經(jīng)薄層色譜初步純化后，氣相-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）分析PC脂肪酸組成和分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，乙醇提取蛋黃PC最適工藝參數(shù)為：料液比（v∶v）為1∶16（g/mL），乙醇濃度93.77%，提取溫度42.98 ℃。在此條件下，PC提取率24.38%，純度61.19%。PC中主要脂肪酸為油酸（40.66%）、軟脂酸（16.35%）、亞油酸（13.06%）、硬脂酸（7.27%）和棕櫚油酸（5.19%），以及少量花生四稀酸（0.48%）和二十二碳六烯酸（0.37%），共鑒定出9種蛋黃PC分子結(jié)構(gòu)，即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14- PC和 16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。

蛋黃磷脂酰膽堿；乙醇提?。恢舅峤M成；分子結(jié)構(gòu)

蛋黃卵磷脂是從雞蛋黃中提取得到的一種天然磷脂混合物，占雞蛋黃干重8%~10%[1-2]，主要分為磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI），及少量溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和鞘磷脂（SM），其中PC含量超過(guò)70%[3-5]。研究表明，卵磷脂具有調(diào)節(jié)血脂[6]、提高記憶力[7]和抗氧化等諸多生理活性[8]。Souza等報(bào)道了卵磷脂作為飼料添加劑，可以降低動(dòng)物膽固醇含量[9]，Lesnierowsk 等報(bào)道了蛋黃卵磷脂在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用[10]。此外，卵磷脂還廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[11-14]。

目前，卵磷脂提取方法包括有機(jī)溶劑萃取 法[15-16]、超聲輔助提取法[17-18]和超臨界萃取 法[19-20]。張椿等采用超聲微波輔助法提取雞蛋卵磷脂，得率為7.5%[2]。范勁松等利用超臨界CO2提取蛋黃卵磷脂，PC得率為17.5%[21]。然而，不同提取方法所得蛋黃PC分子結(jié)構(gòu)種類是不一樣的。陳晉等采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）與氣相質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)鑒定出9種蛋黃PC分子結(jié)構(gòu)[22]，Ali等運(yùn)用UPLC-Q-TOF/MS鑒定出20種蛋黃PC分子結(jié)構(gòu)[23]。

本文以雞蛋蛋黃粉為原料，采用丙酮脫油、乙醇溶劑提取PC，響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝參數(shù)，所得PC提取物經(jīng)薄層色譜純化，利用GC-MS和MALDI-TOF/MS分析PC脂肪酸組成和分子結(jié)構(gòu)，為蛋黃卵磷脂產(chǎn)品開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋：蜜兒樂(lè)兒乳業(yè)（上海）有限公司；蛋黃磷脂酰膽堿（PC）標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；硅膠板：青島海洋化工廠；丙酮、乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-101S磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-756紫外分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；Autoflex III Smartbeam MAIDI-TOF/MS儀：德國(guó)布魯克公司。

1.2 PC提取與含量測(cè)定

1.2.1 工藝流程

圖1 蛋黃卵磷脂提取工藝流程

1.2.2 丙酮脫脂

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的干燥蛋黃粉，放入燒杯中，然后加入丙酮，蛋黃粉/丙酮重量體積比（g/mL）為1∶4、1∶7、1∶10、1∶13和1∶16，磁力攪拌進(jìn)行脫脂處理，脫脂時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h。脫脂完成后，抽濾，將濾餅置入恒溫干燥箱中，40 ℃干燥1.5 h，得丙酮不溶物，計(jì)算得率。以丙酮不溶物得率大小，考察丙酮脫脂效果。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 乙醇提取PC的單因素實(shí)驗(yàn)

以上述丙酮脫脂后的蛋黃粉為原料，考察了乙醇法提取PC的4個(gè)主要影響因素：提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h）、料液比（1∶4、1∶7、1∶10、1∶13和1∶16 g/mL）、乙醇濃度（60%、70%、80%、90%和100%）和提取溫度（20、30、40、50和60 ℃）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 乙醇提取PC的響應(yīng)面優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，料液比、乙醇濃度和溫度對(duì)乙醇法提取PC效果影響最大。為此，采用響應(yīng)面Box-Benhken實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了三因素三水平，以PC提取率為因變量，優(yōu)化上述3個(gè)因素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 分光光度法測(cè)定PC含量與PC提取率計(jì)算

乙醇提取物中PC含量的測(cè)定采用分光光度法進(jìn)行[17]。首先，配制濃度為10 mg/mL的蛋黃磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品母液，用乙醇進(jìn)行適當(dāng)稀釋。全波長(zhǎng)掃描標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液，PC最大吸收峰為210 nm。然后，以濃度為0、10、20、30、40和50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，210 nm測(cè)定吸光值，以PC濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（= 0.007 6– 0.001 2，2= 0.997 3）。每一個(gè)樣品做3次平行，取平均值。最后，在210 nm條件下測(cè)定PC樣品的吸光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中PC含量，同時(shí)，以下公式計(jì)算PC提取率：

式中：Y為PC提取率（%）；為樣品中PC濃度（μg/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為脫脂蛋黃粉質(zhì)量（mg）。

1.3 PC結(jié)構(gòu)中的脂肪酸組成與分子結(jié)構(gòu)分析

1.3.1 薄層色譜純化

將PC提取物和標(biāo)準(zhǔn)品分別用無(wú)水乙醇溶解，用毛細(xì)管吸取樣液后，點(diǎn)在距薄層板底部1 cm處，待干燥后，將薄層板放入裝有展開劑（氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4，v/v/v）的層析缸中展開，然后用碘蒸氣顯色進(jìn)行觀察[24]。

1.3.2 GC-MS分析PC脂肪酸組成

甲酯化[25]：準(zhǔn)確稱取30 mg樣品放入具塞試管中，加入12%三氟化硼甲醇溶液2 mL，在80 ℃水浴下反應(yīng)10 min，冷卻后加入0.05 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，再在80 ℃水浴下反應(yīng) 10 min，冷卻后加入5 mL飽和氯化鈉溶液清洗，最后，加入2 mL正己烷溶液提取，吸取上層液，加入少量無(wú)水硫酸鈉吸收水分，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，裝瓶用于GC-MS分析。

GC-MS分析：色譜柱：DB-5MS UI（Agilent，J&W Scientific，30 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流比為10∶1，載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。升溫程序：100 ℃保持 2 min，以6 ℃/min升至320 ℃保持10 min。離子源溫度為220 ℃，接口溫度為280 ℃，溶劑峰切除時(shí)間3 min，掃描范圍：45~500 m/z。

1.3.3 MALDI-TOF/MS分析PC分子結(jié)構(gòu)

將1 μL基質(zhì)溶液點(diǎn)到板子上揮發(fā)干后，再將1 μL待測(cè)溶液點(diǎn)到基質(zhì)上，揮發(fā)干溶劑后進(jìn)行檢測(cè)。儀器：配備337 nm氮分子激光器的MAIDI- TOF/MS（BrukerAutoflex III），加速電壓為20 kV，基質(zhì)為2, 5-二羥基苯甲酸（2,5-DHB），發(fā)射模式為正離子模式，掃描范圍：300~1 000 m/z。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Design expert 8.0軟件處理和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酮對(duì)蛋黃粉脫脂效果的影響

分別考察蛋黃粉/丙酮料液質(zhì)量體積比和脫脂時(shí)間對(duì)脫脂效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2a可知，總體趨勢(shì)為料液比增大，脫脂效果越好，即丙酮不溶物得率下降。當(dāng)料液比1∶10時(shí)，丙酮不溶物得率為55.49%。進(jìn)一步加大料液比，丙酮不溶物得率趨于平緩。為此，丙酮脫脂時(shí)，料液比選擇為1∶10。由圖2b可以看出，隨著延長(zhǎng)脫脂時(shí)間，丙酮不溶物得率變化不大，結(jié)果表明，脫脂時(shí)間對(duì)丙酮脫脂效果的影響較小。考慮到1.5 h時(shí)脫脂效果較好，最終選擇脫脂時(shí)間為1.5 h。

2.2 乙醇提取PC的單因素實(shí)驗(yàn)

以上述脫脂蛋黃粉為原料，探討乙醇法提取蛋黃PC的工藝技術(shù)，分別考察提取時(shí)間、料液比（質(zhì)量體積比）、乙醇濃度和提取溫度對(duì)PC得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖2 丙酮脫脂效果的影響

圖3 乙醇提取脫脂蛋黃粉PC的影響因素分析

由圖3a可知，延長(zhǎng)提取時(shí)間可適當(dāng)提升PC產(chǎn)品得率，在1 h時(shí)達(dá)到最大值16.95%，之后PC提取率略微下降并趨于平緩。這說(shuō)明乙醇提取1 h，絕大部分PC已經(jīng)溶解在乙醇中，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，PC提取率沒有變化，反而造成時(shí)間的浪費(fèi)，增加提取能耗和成本。因此，提取時(shí)間選擇1 h。

由圖3b可以看出，料液比對(duì)PC提取率影響較明顯，增大料液比，PC提取率明顯增加。較低料液比（≤1∶6），蛋黃粉與乙醇溶液不能充分混勻，且易使乙醇溶解PC達(dá)到飽和狀態(tài)，導(dǎo)致PC提取率偏低。提高料液比，蛋黃粉與乙醇溶液接觸充分，PC提取率隨之增加。是當(dāng)料液比為1∶13，PC提取率逐漸趨于平穩(wěn)，提取率穩(wěn)定在15.56%。因此，料液比選取1∶13。

圖3c顯示，乙醇濃度明顯影響PC提取率。乙醇濃度為60%時(shí)，PC提取率低（約3%），增加乙醇濃度，PC提取率顯著增加。乙醇濃度為90%時(shí)，PC提取率達(dá)到最大值22.93%，進(jìn)一步增加乙醇濃度，PC提取率反而開始下降，原因是乙醇濃度增加，其它醇溶性的雜質(zhì)也隨之提取出來(lái)。因此，乙醇濃度選取90%。

圖3d顯示，提取溫度≤40 ℃時(shí)，PC提取率隨提取溫度升高而增加，原因是溫度升高加速了分子運(yùn)動(dòng),可以加速傳質(zhì)過(guò)程。提取溫度為40 ℃時(shí)，PC提取率最高，為23.76%。然而，繼續(xù)提高提取溫度，PC提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。原因可能是PC熱敏性所導(dǎo)致，高溫下PC不穩(wěn)定且易發(fā)生氧化作用，致使PC提取率降低。因此，提取溫度選取為40 ℃。

2.3 乙醇提取PC工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)表1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化乙醇提取PC的主要工藝參數(shù)，結(jié)果見表2。

使用Design expert 8.0軟件，對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，PC得率（）的回歸方程為：

=0.25+0.006 6+0.030+0.013+0.001 7– 0.001 1–0.011–0.0202–0.0382–0.00132

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，模型校正決定系數(shù)2Adj為0.961 1，表明模型預(yù)測(cè)值有96.11%的可信度。模型確定系數(shù)2=0.983 0，說(shuō)明該模型擬合度好，誤差小。從表3中還可以看出，回歸模型<0.000 1，失擬項(xiàng)值為0.331 2（>0.05），進(jìn)一步表明模型顯著性極好，偏差小。方差分析結(jié)果表明，模型一次項(xiàng)，交互項(xiàng)顯著影響PC提取率（< 0.05）；一次項(xiàng)、，二次項(xiàng)2、2和2極顯著影響PC提取率（< 0.01）；交互項(xiàng)和不顯著。由值大小可知，各因素對(duì)PC提取率的影響作用貢獻(xiàn)大小為：乙醇濃度（）>提取溫度（）>料液比（）。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

注：* 表示差異顯著（<0.05）；** 表示差異極顯著（<0.01）。

根據(jù)響應(yīng)面等高圖（如圖4）可以直觀地獲得乙醇提取PC的最佳工藝參數(shù)：料液比1∶16 （g∶mL），乙醇濃度93.77%，提取溫度42.98 ℃。在此條件下，PC得率預(yù)測(cè)值為24.38%?？紤]實(shí)際操作要求，最終確定實(shí)驗(yàn)條件為：料液比1∶16（g∶mL），乙醇濃度94%，提取溫度43 ℃。為驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，PC提取率平均為24.23%，與模型預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.62%，表明該模型擬合度高，重復(fù)性好。

A、B：乙醇濃度和料液比交互作用；C、D：溫度和料液比交互作用；E、F：乙醇濃度和溫度交互作用

2.4 PC分子結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 薄層色譜分離純化PC

考察3種不同展開劑對(duì)PC分離純化的影響，以PC標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，結(jié)果見圖5。由圖5中可知，二氯甲烷/甲醇/水作展開劑，無(wú)法有效分離純化PC（如圖5A和B）。展開劑為氯仿∶甲醇∶水= 65∶25∶4(v/v/v)，PC和PE可有效分開（如圖5C）。分光光度法測(cè)定純化后PC含量，為61.19%，比粗提物PC含量提高近3倍。

A 二氯甲烷∶甲醇∶水=65∶20∶4，v/v/v；B 二氯甲烷∶甲醇∶水=60∶20∶4，v/v/v；C 氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4，v/v/v

2.4.2 GC-MS分析PC脂肪酸組成

分離純化所得PC甲酯化后，進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖見圖6所示，與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比，得到7種脂肪酸組成，列舉表4中。由此可知，蛋黃PC脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，占總脂肪酸58.91%。主要脂肪酸組成為油酸（40.66%）、軟脂酸（16.35%）、亞油酸（13.06%）、硬脂酸（7.27%）和棕櫚油酸（5.19%）。同時(shí)，蛋黃PC中還含有少量的花生四稀酸（0.48%）和二十二碳六烯酸（0.37%）。

圖6 GC-MS總離子流色譜圖

2.4.3 MALDI-TOF/MS分析PC分子結(jié)構(gòu)

MALDI-TOF/MS結(jié)合GC-MS是分析蛋黃PC分子結(jié)構(gòu)的有效方法[26]。在正離子模式下得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖，截取m/z為750~850進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7。質(zhì)譜結(jié)果表明，從蛋黃中分離的PC具有7種不同類型的脂肪酸和9種分子結(jié)構(gòu)，這和Chen等的研究結(jié)果一致[27]。結(jié)合GC-MS脂肪酸種類及雙鍵所在位置，9種蛋黃PC的分子結(jié)構(gòu)如圖8所示，即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/ 18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC和16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。由此可見，蛋黃PC中含有較高的不飽和脂肪酸，包括棕櫚油酸、亞油酸、油酸、花生四稀酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA）,這些不飽和脂肪酸與人體健康息息相關(guān)。

表4 蛋黃PC脂肪酸組成

圖7 MALDI-TOF質(zhì)譜圖

圖8 蛋黃PC的分子結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

采用丙酮脫脂、乙醇提取的方法提取蛋黃粉中的PC，獲得最佳提取工藝參數(shù)：料液比1∶16 （g/mL），乙醇濃度93.77%，提取溫度42.98 ℃。在此條件下，PC提取率為24.23%，與模型預(yù)測(cè)值（24.38%）相比，相對(duì)誤差為0.62%。PC粗提物經(jīng)薄層色譜分離純化、MALDI-TOF/MS聯(lián)用GC-MS分析，得到9種蛋黃PC的分子結(jié)構(gòu)，即16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC, 18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/ 18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC,18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14-PC和16:0/ 22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC。

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備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。

Egg yolk phosphatidylcholine enrichment in unsaturation fatty acids: Extraction and molecular structure

ZHU Shuai1, HUANG Meng-ling1, FAN Li1, YANG Rui-peng2, ZHANG Min2, LIU Yun1

(1. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China; 2. Mille Dairy (Shanghai) Co. Ltd, Shanghai 200335, China)

Egg yolk is rich in phosphatidylcholine (PC), which is the keyphospholipid component providing nourishment and protection for our body. We herein optimize the ethanol extraction parameters for PC in egg yolk using response surface methodology. After preliminary purification through thin-layer chromatography, PCfatty acid compositions are identified by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS), and their molecular structure are also elucidated by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscope (MALDI- TOF/MS). Results show that the optimal parameters for PC extraction from egg yolk are: weight/volume ratio of egg yolk to ethanol of 1∶16 (g:mL), ethanol concentration of 93.77%, extraction temperature of 42.98 ℃. Under the optimal conditions, 24.38% of PC yield is obtained, and PC content is approx.61.19% detected by UV-Vis spectroscopy. GC-MS analysis reveals that the main fatty acids of PC are oleic acid (40.66%), palmitic acid (16.35%), linoleic acid (13.06%), stearic acid (7.27%), palmitoleic acid (5.19%) and a small amount ofarachidonic acid (0.48%) and docosahexaenoic acid (0.37%). Nine kinds of PC molecular structures are elucidated from MALDI-TOF/MS profiles, namely, 16:0/18:0-PC, 16:0/18:1Δ9-PC,18:0/18:1Δ9-PC, 16:0/18:2Δ9,12-PC, 18:0/18:2Δ9,12-PC, 18:1Δ9/18:2Δ9,12-PC, 16:0/20:4Δ5,8,11,14-PC, 18:0/20:4Δ5,8,11,14- PC and 16:0/22:6Δ3,6,9,12,15,18-PC.

egg yolk; phosphatidylcholine (pc); ethanol extraction; fatty acid composition; molecular structure

TS201.1

A

1007-7561(2020)03-0010-08

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.002

2020-03-02

企業(yè)委托項(xiàng)目（H2019167）

朱帥，1997年出生，男，碩士生，研究方向?yàn)槁蚜字a(chǎn)品開發(fā).

劉云（ORCID：0000-0002-7521-3831），男，教授，博導(dǎo)，研究方向?yàn)楣δ苁称泛蜕镔Y源利用, E-mail: liuyun@meil.buet.edu.cn

2020-04-17 11:08:13

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3863.TS.20200417.1028.004.html