體外法研究添加不同比例葡萄籽對多浪羊瘤胃發(fā)酵及底物降解的影響

彭婉婉，許貴善,2*，馬忠杰，張皙藤，鳥鵬穎

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

新疆是少數(shù)民族群眾聚居區(qū)，對牛、羊肉等畜產(chǎn)品需求極大，但新疆尤其是南疆草地沙漠化嚴重，飼草資源短缺，飼料資源的開發(fā)和高效利用極其重要。新疆得天獨厚的種植條件使其成為世界上三大適宜葡萄栽培的黃金區(qū)域之一。葡萄釀酒加工過程中產(chǎn)生大量的葡萄渣，主要成分是葡萄皮和葡萄籽，約占鮮果重量的20%[1]。

前人研究表明，葡萄渣用于養(yǎng)殖可以提高肉羊的生產(chǎn)性能、屠宰性能和部分養(yǎng)分的可消化性[2-3]。葡萄渣作為飼料或添加劑極具利用價值，但其中所含的單寧對反芻動物日糧蛋白質(zhì)的消化吸收和代謝具有抑制作用，是限制葡萄渣添加量的主要因素[4]。飼喂過量的葡萄渣會使動物采食量下降，增加飼養(yǎng)成本，降低飼料養(yǎng)分的利用效率[5]。另外，葡萄渣中皮和籽的比例使其中的營養(yǎng)物質(zhì)含量波動較大，研究結(jié)果不盡相同。葡萄籽營養(yǎng)物質(zhì)含量穩(wěn)定，但單寧含量較高，研究葡萄籽在肉羊飼料中的適宜添加量可為開發(fā)利用葡萄籽資源，提高蛋白質(zhì)利用效率提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

前人研究主要集中于葡萄渣，對葡萄籽添加比例的研究較少。本研究使用體外法探索葡萄籽在多浪羊全價日糧中的適宜添加量，以期為開展飼養(yǎng)試驗提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為葡萄籽及葡萄渣等副產(chǎn)物在肉羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液供體動物 瘤胃液供體動物為16 只健康、體況良好、體重（33.0±3.2）kg 的多浪羊公羊（裝有永久性瘤胃瘺管，外徑9.8 cm，內(nèi)徑3.9 cm）。

1.2 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理 參照 NRC[6]（2007）配制體重為 30 kg、日增重為 150 g/d 綿羊營養(yǎng)需要量的全混顆粒飼料，由阿克蘇某飼料公司代為生產(chǎn)。每天09:00和21:00 各飼喂1 次，自由飲水，單欄飼養(yǎng)，飼喂15 d后于晨飼前采集瘤胃液。

1.3 試驗設(shè)計 試驗設(shè)計了8 種飼料樣品，將育肥羊全價配合飼料粉碎過篩，葡萄籽來自新疆伊犁某葡萄酒廠，自然干燥后葡萄籽含水分9.93%，干物質(zhì)（DM）中含灰分3.02%、粗蛋白質(zhì)（CP）9.24%、粗脂肪16.25%、中性洗滌纖維60.52%、酸性洗滌纖維51.77%。葡萄籽自然干燥后用中草藥粉碎機粉碎過40 mm 篩孔，按0%、4%、8%、12%、16%、20%、24% 和28% 的比例分別添加至經(jīng)粉碎過40 mm 篩孔的育肥羊全價配合飼料中。

1.3.1 體外產(chǎn)氣試驗 準確稱取1.000 0 g 樣品倒入產(chǎn)氣瓶底部，每種飼料樣品過40 mm 篩稱3 個平行樣，試驗設(shè)空白對照3 個（空白對照不放飼料樣品）。試驗當天于晨飼前采集瘤胃液，采集的瘤胃液用4 層紗布過濾，殘渣塞回瘤胃中，過濾后的瘤胃液裝在溫水預(yù)熱的暖瓶中迅速帶回試驗室。人工唾液配制使用Menke 法[7]，人工唾液配制好后通入CO2，然后人工唾液和瘤胃液按2:1 比例混合成人工瘤胃液，每個產(chǎn)氣瓶中倒入100 mL人工瘤胃液，在瓶口通入CO2，迅速蓋上蓋子，放到39℃恒溫搖床中，連接體外產(chǎn)氣監(jiān)測系統(tǒng)（ANKOM，RFS 產(chǎn)氣測量系統(tǒng)），記錄時間頻率設(shè)為0.5 h/次。

1.3.2 尼龍袋體外發(fā)酵試驗 稱取1.3 g 左右樣品，裝入孔徑為50 μm，8 cm×6 cm 的尼龍袋中，系口后稱重。將7 個時間點的21 個尼龍袋一次性投入4 L 的發(fā)酵罐內(nèi)，每個時間點3 個平行樣用尼龍繩系在一起，留線固定在瓶身外側(cè)，便于取出。人工瘤胃液配制同體外產(chǎn)氣試驗，每個發(fā)酵罐中倒入1 000 mL 人工瘤胃液，瓶口通入CO2，迅速蓋上蓋子，放入39℃紅外線加熱、自動旋轉(zhuǎn)的瘤胃體外模擬裝置（ANKOM Daisy 自動體外培養(yǎng)箱）中，模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境及蠕動過程。在發(fā)酵后2、4、8、12、24、36、48 h 從發(fā)酵罐中快速取出尼龍袋，取樣時通入CO2保持發(fā)酵罐內(nèi)厭氧環(huán)境。

1.4 樣品的采集及處理

1.4.1 體外產(chǎn)氣試驗樣品采集及處理 發(fā)酵開始后第48小時停止試驗，保存產(chǎn)氣數(shù)據(jù)，將產(chǎn)氣瓶快速放入冰水中，終止微生物活動，測定發(fā)酵液的pH，然后將產(chǎn)氣瓶中的瘤胃液搖勻，取50 mL 瘤胃液于離心管中，1 500 ×g，39℃離心15 min，吸取4 mL 上清液于5 mL離心管中（預(yù)先加1 mL 1%的H2SO4溶液冷凍保存），用于測定氨態(tài)氮（NH3-N）濃度；取30 mL 上清液，用于測定菌體蛋白（MCP），所有樣品均保存在-20℃冰箱中。

表1 育肥羊全價配合飼料日糧營養(yǎng)配方及營養(yǎng)成分（風干基礎(chǔ)）

1.4.2 尼龍袋體外發(fā)酵試驗樣品采集及處理 在試驗開始2、4、8、12、24、36、48 h 分別從每個發(fā)酵罐中取3 個尼龍袋，將尼龍袋在自來水下輕輕按壓，沖洗干凈，在65℃烘箱內(nèi)烘12 h，烘干后回潮24 h，用于測定干物質(zhì)降解率、粗蛋白質(zhì)降解率。取尼龍袋同時測發(fā)酵液的pH，吸取4 mL 瘤胃液于5 mL 離心管中（預(yù)先加1 mL 1% 的H2SO4溶液冷凍保存），-20℃冷凍保存，用于測定NH3-N 濃度，取樣過程要通入CO2保持厭氧環(huán)境。

1.5 樣品測定 使用ANKOM RFS 體外產(chǎn)氣監(jiān)測系統(tǒng)記錄產(chǎn)氣量；發(fā)酵液pH 使用FiveEasy FE22 pH 計；發(fā)酵液NH3-N 濃度采用馮宗慈比色法[8]；飼料中CP 含量使用凱氏定氮法[9]；發(fā)酵液中MCP 含量使用凱氏定氮法，取30 mL 瘤胃上清液4℃ 21 000×g 離心20 min，留沉淀，用15 mL 生理鹽水洗滌沉淀2 次，沉淀用10 mL 濃硫酸分3 次沖洗到消煮管中測定MCP 含量[10-11]。

1.6 統(tǒng)計分析

1.6.1 體外產(chǎn)氣試驗數(shù)據(jù)處理 根據(jù)ANKOM 體外產(chǎn)氣監(jiān)測系統(tǒng)數(shù)據(jù)表的壓力值，換算成大氣壓下的產(chǎn)氣量，得到的產(chǎn)氣量減去空白對照的產(chǎn)氣量。產(chǎn)氣量計算公式：

GP=a+b×（1－e-ct）

式中，GP 為t 時刻的產(chǎn)氣量（mL/g DM）；a 為快速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量（mL/g DM）；b 慢速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量（mL/g DM）；c 為產(chǎn)氣速率（%/h）。

1.6.2 尼龍袋體外發(fā)酵試驗數(shù)據(jù)處理 參照?skov 等[12]提出的瘤胃動力學(xué)數(shù)學(xué)模型計算各時間點營養(yǎng)物質(zhì)降解率和營養(yǎng)物質(zhì)有效降解率，計算公式：

dP=a+b ×（1－e-ct）；

ED=a+bc/（k+c）。

式中，dP 為待測飼料的營養(yǎng)物質(zhì)瘤胃某一時間點的降解率（%）；a 為快速降解部分含量（%）；b 為慢速降解部分含量（%）；c 為慢速降解部分的降解速率（%/h）；t 為瘤胃內(nèi)培養(yǎng)時間（h）；ED 為有效降解率（%）；k為瘤胃外流速率，本試驗中k 值取0.021%/h[13]。

營養(yǎng)物質(zhì)在不同時間點的降解率計算公式：

A=100×（B－C）/B

式中，A 為待測飼料的所測營養(yǎng)物質(zhì)物質(zhì)某一時間點的消失率（%）；B 為待測樣品中所測營養(yǎng)物質(zhì)的含量（%）；C 為待測樣品尼龍袋殘渣中所測營養(yǎng)物質(zhì)含量（%）。

利用SAS 9.2 的非線性（NLIN）方程對產(chǎn)氣參數(shù)和降解參數(shù)進行分析，所有數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 軟件中的單因素方差分析進行顯著性檢驗，LSD 多重比較差異，以P＜0.05 為差異顯著性判斷標準，結(jié)果用平均值和SEM 表示。

2 結(jié)果

2.1 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 的產(chǎn)氣量 由表2 可知，在產(chǎn)氣試驗開始后的2、4、8、12 h，各組的產(chǎn)氣總量隨時間而增加，除24% 添加組2 h 產(chǎn)氣量與對照組有顯著差異外，其他各試驗組2、4、8、12 h的產(chǎn)氣量和0%組差異均不顯著。隨著葡萄籽添加比例的增長，各組12、24、36、48 h 的產(chǎn)氣量先增長后減少，4%、8%、12% 和16% 添加組48 h 的潛在產(chǎn)氣量差異不顯著；16%添加組的潛在產(chǎn)氣量顯著高于各組，為121.03 mL/g。

表2 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 的產(chǎn)氣量

2.2 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時間點的干物質(zhì)降解率 如表3 所示，隨著飼料在人工瘤胃液中發(fā)酵時間的增加，干物質(zhì)的降解率增大；隨著葡萄籽添加比例增加，各組的干物質(zhì)降解率降低，0%添加組的干物質(zhì)有效降解率顯著高于16%、20%、24%組。

2.3 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時間點的粗蛋白質(zhì)降解率 由表4 可見，各時間點的粗蛋白質(zhì)降解率隨著發(fā)酵時間的延長而增大；在發(fā)酵的2～24 h，各試驗組的粗蛋白質(zhì)降解率與0%添加組無顯著差異。在發(fā)酵的36～48h，16%、20%和24%添加組粗蛋白降解率顯著低于0%添加組，0%、4%、8%、12%添加組粗蛋白降解率差異不顯著。16%、20% 和24% 添加組粗蛋白質(zhì)48 h 有效降解率顯著低于0%添加組。

2.4 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵各時間點的NH3-N、MCP 濃度及pH 表5 結(jié)果顯示，體外發(fā)酵8～48 h 發(fā)酵液的NH3-N 濃度隨著發(fā)酵時間的延長整體呈增長趨勢。從表6 可以看出，16% 添加組的NH3-N濃度最低，顯著低于0%添加組；隨著葡萄籽添加比例的增加，發(fā)酵液中MCP 濃度整體呈下降趨勢，12%、16%、20%、24%添加組MCP 濃度顯著低于0%添加組。隨著葡萄籽添加量的增加，發(fā)酵液pH 增高，除4%和8%添加組，各試驗組的pH 顯著高于0% 添加組。由圖1可見，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液的pH 降低，在發(fā)酵后的2～8 h，pH 降低速率較大。

3 討 論

3.1 葡萄籽添加比例對全價日糧體外產(chǎn)氣量的影響 碳水化合物和蛋白質(zhì)在瘤胃中被微生物降解產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸以及H2、CO2和甲烷等氣體，飼料在瘤胃中的產(chǎn)氣量能反映飼料被瘤胃微生物利用的程度。試驗證明飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化率與體外發(fā)酵的產(chǎn)氣量有較高相關(guān)性[14]。米熱古麗等[15]體外試驗證實，葡萄籽精油能夠顯著提高發(fā)酵底物的總產(chǎn)氣量；張力莉等[16]研究表明，隨葡萄渣添加量的增加體外產(chǎn)氣量上升；張雪峰等[17]在發(fā)酵底物中添加20%的葡萄籽，72 h 產(chǎn)氣量顯著高于對照組；Chikwanha 等[18]試驗發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中葡萄渣比例的增加，羔羊45 d 平均日增重先增長后下降。本試驗中添加不同比例葡萄籽后產(chǎn)氣量先增長后減少，16%添加組48 h 的有效產(chǎn)氣量最大，與前人研究規(guī)律一致，說明添加適量比例葡萄籽能促進底物被微生物利用，但當葡萄籽添加比例為20% 以上后產(chǎn)氣量有一定程度的下降，說明添加過高比例的葡萄籽后，導(dǎo)致日糧中中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維水平增加，改變了日糧的精粗比結(jié)構(gòu)，從而影響了產(chǎn)氣量[19]。葡萄籽中含有豐富的原花青素，利用鐵鹽催化比色法測定葡萄籽中原花青素含量為80～232 mg/g[20]。Rira 等[21]用3 種富含單寧的植物分別以25%、50% 和75% 的比例與干草混合，24 h體外產(chǎn)氣量均降低，也可能是葡萄籽中單寧影響了瘤胃發(fā)酵模式。

表3 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時間點的干物質(zhì)降解率 %

表4 添加不同比例的葡萄籽體外發(fā)酵48 h 各時間點的粗蛋白質(zhì)降解率 %

表5 尼龍袋體外發(fā)酵8～48 h 的NH3-N 濃度 mg/100mL

表6 體外產(chǎn)氣48h 發(fā)酵液中的pH、NH3-N 和MCP 濃度

圖1 尼龍袋體外發(fā)酵48 h 各時間點的pH

3.2 葡萄籽添加比例對瘤胃干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)降解率的影響 飼料在瘤胃的降解主要是瘤胃微生物和微生物分泌酶作用的結(jié)果，飼料在瘤胃中的降解率是衡量飼料營養(yǎng)價值的重要指標。張力莉等[16]研究發(fā)現(xiàn)在體外試驗中添加葡萄渣干物質(zhì)消化率降低。本試驗中隨著葡萄籽添加比例的增加，飼料樣品的干物質(zhì)降解率下降。干物質(zhì)降解率下降可能是因為葡萄籽中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量較高（40%以上），添加葡萄籽使飼料中粗纖維含量升高，而纖維性飼料作為反芻動物飼料本就存在消化率低的特點[22]。

李會菊等[23]研究發(fā)現(xiàn)在綿羊日糧中添加16% 和24%的葡萄籽均顯著降低粗蛋白質(zhì)表觀消化率；高新梅等[24]以瘤胃尼龍袋法測得TMR 日糧中添加4%以上的葡萄渣可以顯著降低蛋白質(zhì)有效降解率。Bruno-Soares等[25]在羽扇豆中添加不同量的葡萄籽提取單寧，蛋白質(zhì)瘤胃降解率顯著降低。楊凱[26]的研究結(jié)果表明，添加6.5、13.0、26.0 g/kg 單寧酸分別使蛋白質(zhì)消化率降低5.0%、8.6%和15.7%。本試驗添加16%以上的葡萄籽顯著降低蛋白質(zhì)有效降解率，與前人研究規(guī)律一致，可能是葡萄籽中含有豐富單寧降低了蛋白質(zhì)降解率。單寧在植物中通常與植物蛋白質(zhì)通過氫鍵結(jié)合為較穩(wěn)定的單寧蛋白質(zhì)化合物，使得蛋白質(zhì)在瘤胃中的吸收受阻。尚凱寧等[27]研究表明，小麥蛋白中添加高粱單寧，小麥蛋白的體外消化率降低，電鏡下可以觀察到高粱單寧與小麥蛋白質(zhì)絡(luò)合形成難以被消化酶水解的絡(luò)合物。

3.3 葡萄籽添加比例對瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響 微生物的種類決定瘤胃的發(fā)酵模式，瘤胃微生物的活性受pH 影響。瘤胃正常的pH 為5.50～7.00[28]，本試驗中pH 在正常的發(fā)酵范圍內(nèi)。本試驗發(fā)現(xiàn)，pH 隨綿羊全價日糧中添加葡萄籽的比例增高而升高，但張雪峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加葡萄籽對瘤胃pH 無顯著影響，但也有研究發(fā)現(xiàn)添加不同劑量葡萄籽精油提高發(fā)酵液的pH[15]。瘤胃氮代謝過程中外源蛋白質(zhì)和內(nèi)源含氮物質(zhì)降解產(chǎn)生NH3-N。NH3-N 濃度可以反映飼料的降解和吸收程度。大量研究證明，瘤胃內(nèi)NH3-N 的適宜濃度為6.3～27.5 mg/100mL[29]。菌體蛋白（MCP）是反芻動物重要的蛋白質(zhì)氮源，NH3-N 也是瘤胃微生物合成（菌體蛋白）的原料，NH3-N 和菌體蛋白濃度具有較高的相關(guān)性，因此可以NH3-N 濃度推測瘤胃微生物合成作用的強弱[30]。Abarghuei 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中加入葡萄渣會降低瘤胃液發(fā)酵液NH3-N 濃度；趙棟等[32]以連續(xù)動態(tài)人工瘤胃試驗得出結(jié)果，添加14%～16%的葡萄渣顯著降低瘤胃液NH3-N 濃度；劉潔等[20]試驗中精粗比的降低也引起瘤胃了NH3-N 濃度的下降。本試驗體外發(fā)酵48 h隨著葡萄籽添加比例的增加發(fā)酵液中的NH3-N 濃度雖有波動但總體呈下降趨勢，與前人研究結(jié)果一致，說明添加過高比例葡萄籽使瘤胃pH 升高、NH3-N 濃度降低，瘤胃細菌數(shù)量減少，間接地降低了瘤胃微生物利用NH3-N 合成瘤胃微生物蛋白的速率，最終降低了瘤胃MCP 產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，全價日糧中添加8%～16% 的葡萄籽可以提高飼料的產(chǎn)氣量，添加16% 以上的葡萄籽粗蛋白質(zhì)有效降解率顯著降低，瘤胃pH 升高，干物質(zhì)降解率降低。從體外產(chǎn)氣試驗和體外發(fā)酵試驗來看，綿羊日糧中葡萄籽的適宜添加比例為8%～12%。