精胺對雌鵝卵巢生殖激素受體基因表達的影響

易治鑫，李林祥，徐 進，李 苗，姜冬梅

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川成都 611130；2.巴中市農(nóng)林科學研究院，四川巴中 636000）

多胺（腐胺、亞精胺和精胺）在蛋白質生物合成、細胞增殖、分化和凋亡過程均具有重要調控作用[1-3]，多胺還能作為抗癌和抑癌藥物的靶點[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，生殖激素對多胺代謝酶表達及其活性具有重要調控作用[7-9]，而多胺與激素受體之間也存在著某種復雜聯(lián)系。Kang等[1,10]研究發(fā)現(xiàn)，干擾OAZ1會抑制鵝顆粒細胞促黃體生成素受體（Luteinizing Hormone Receptor，LHR）基因表達，而過表達OAZ1則會促進促卵泡激素受體基因（Follicle Stimulating Hormone Receptor，F(xiàn)SHR）和LHR表達。龍詩韻等[11]研究發(fā)現(xiàn)，0.15 mg/g 亞精胺能促進小鼠卵巢FSHR表達，下調LHR表達。月經(jīng)周期的女性血漿雌二醇（E2）水平首次增加時伴隨精胺含量最高峰，而E2與其受體的識別受到多胺調控[2,12]。高濃度亞精胺能介導小鼠卵巢雌激素受體（Estradiol Receptor,ER）基因的表達調控卵巢功能[11]。干擾OAZ1后顆粒細胞ER1表達下調，而過表達OAZ1后ER1表達上調[1,10]，提示多胺或多胺代謝基因能調控激素受體基因的表達。綜上所訴，多胺或多胺代謝基因能介導生殖激素受體基因表達進而參與調控動物繁殖。然而，目前并不清楚外源性多胺是否會通過介導雌性動物生殖激素受體表達來參與調控動物性腺發(fā)育，同時尚未見有關多胺對早期性腺發(fā)育過程中性腺激素受體基因影響的報道。而近年來有研究表明精胺在雌性動物繁殖過程中具有重要調控作用[13-14]。因此，本研究用精胺灌胃雛鵝，探討精胺對發(fā)育早期雌鵝卵巢組織FSHR、LHR、ER1和ER2表達的影響，以期為多胺調控家禽繁殖功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 選擇同批孵化、體況一致的28 日齡四川白鵝母鵝12 只。隨機分為對照組（灌胃禽用生理鹽水）和試驗組（按5 mg/kg 體重的灌胃劑量灌胃精胺，每只鵝每次灌胃量為300 μL，精胺用超純水溶解配制）。自由采食和飲水，每天于08:00 和20:00分別灌胃，連續(xù)灌胃2 周，分別于第8 天和第14 天進行稱重。灌胃結束后，采集翅靜脈血液5 mL 后頸部放血致死，迅速采集卵巢組織并稱重。血液樣品靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，收集血清。平均日增重=（結測體重－始測體重）/ 測定天數(shù)，卵巢指數(shù)（g/kg）=卵巢鮮重/活體重。

1.2 組織總RNA 提取與cDNA 模板制備 全部卵巢組織樣品總RNA 參照Trizol 試劑（TaKaRa，大連）操作說明書提取，分別取5 μL 總RNA 于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質量。組織樣品cDNA 反轉錄參照M-MLV 試劑盒（TaKaRa，大連）操作說明進行，并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實時熒光定量PCR 實時熒光定量反應體系為50 μL：iQTM SYBR?Green Supremix（Bio-Rad，USA）25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，cDNA 模板2.0 μL，RNase Free H2O 19.0 μL。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，依據(jù)表1 中引物退火溫度退火30 s，72℃延伸30 s（采集熒光），45 個循環(huán)；95℃ 10 s，60℃ 1 min，繪制熔解曲線。以GADPH作為內參基因，按照上述實時熒光定量PCR 反應體系和反應參數(shù)設置，定量檢測四川白鵝卵巢組織樣品中FSHR、LHR、ER1和ER2基因相對表達量，每個樣品設3 個重復。實時熒光定量PCR 引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計分析 根據(jù)熒光定量PCR 檢測的目的基因Ct值，利用Excel 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。采用2-ΔΔCt法計算得出卵巢組織中FHSR、LHR、ER1和ER2基因的相對表達量。應用t 檢驗進行顯著性分析，顯著水準為α=0.05，結果表示為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 精胺對鵝平均日增重和卵巢指數(shù)的影響 如圖1 所示，給雛鵝灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，灌胃精胺組雛鵝平均日增重與對照組相比無顯著差異。如圖2 所示，給雛鵝灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，灌胃精胺組卵巢重和卵巢指數(shù)與對照組相比均無顯著差異。

2.2 精胺對鵝卵巢FSHR、LHR、ER1和ER2基因表達的影響 如圖3 所示，給雛鵝灌胃5 mg/kg 精胺2 周后，精胺處理組雛鵝卵巢組織中LHR和ER2表達量分別是對照組的4.78 倍和1.65 倍（P＜0.05）；而雛鵝卵巢組織中FSHR和ER1表達量與對照組相比無顯著差異。

圖1 精胺對鵝平均日增重的影響

圖2 精胺對鵝卵巢重（A）和卵巢指數(shù)(B)的影響

圖3 精胺對鵝卵巢FSHR、LHR、ER1 和ER2 基因表達量

3 討 論

生殖激素促進性腺發(fā)育和調控繁殖的功能需要通過受體識別和結合才能實現(xiàn)，而卵巢生殖激素受體的表達變化則會影響生殖激素的作用效應。與FSH 結合并產(chǎn)生效應的FSHR 主要分布于卵巢組織中，與卵母細胞的發(fā)育和成熟有關[15]；有研究認為，卵巢和卵泡中FSHR基因的表達量可能與家禽的性早熟有關[16]，提示FSHR基因能參與調控家禽性腺早期發(fā)育。本實驗中，雛鵝灌胃2 周精胺后，鵝卵巢FSHR基因表達與對照組無顯著差異，與上述研究結果不一致，推測在體成熟前雛鵝性腺發(fā)育相較遲緩，卵巢維持FSHR水平可能與機體為避免性早熟有關，這一推測還有待進一步研究證實。

Thyssen 等[17]研究發(fā)現(xiàn)外源性多胺能抑制促黃體生成素（LH）的分泌。而二氟甲基鳥氨酸（ODC 不可逆抑制劑）處理排卵前大鼠后，血漿中LH 含量降低，表明多胺能介導LH 水平參與調控繁殖[18]。據(jù)報道，在卵泡發(fā)育早期就有LHR基因開始表達，且與卵巢mRNA 水平有關[19-20]。在鵝卵巢發(fā)育早期，精胺能顯著促進LHR基因表達，而LHR基因的表達是LH 發(fā)揮調控性腺發(fā)育和繁殖功能的保證，提示精胺能介導LHR基因的表達參與調控鵝早期卵巢發(fā)育[15,21]。

據(jù)報道，當多胺合成受到抑制時，E2與其受體之間的結合將會受到影響[12,22]，而精胺可能與E2和ER的結合識別有關[2]。ER 有ER1 和ER2 2 種亞型，敲除ER基因后的雌鼠缺乏生殖能力，竇卵泡生長受到抑制，并出現(xiàn)多囊性卵泡。因此，ER對卵巢卵泡發(fā)育具有重要作用[23]。有研究表明，在卵巢發(fā)育過程中ER2比ER1具有優(yōu)勢[23-25]。康波等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在鵝卵巢發(fā)育早期均能檢測到ER1和ER2，并認為在介導雌激素調控卵巢發(fā)育及卵巢功能中ER2 更具優(yōu)勢。經(jīng)精胺灌胃后發(fā)現(xiàn)鵝卵巢ER2基因表達量顯著，而ER1基因表達無顯著差異，提示精胺可介導ER2基因表達參與調控雛鵝早期卵巢發(fā)育，進一步證實ER2 在早期卵巢發(fā)育中發(fā)揮主要作用。

4 結 論

外源性精胺可促進雛鵝卵巢組織ER2和LHR基因的表達，提示精胺能夠通過介導卵巢生殖激素受體的表達影響鵝的早期卵巢發(fā)育。