高粱單寧的結(jié)構(gòu)、分布及分析方法綜述

鄭學玲，王旭娟，韓小賢

河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

高粱單寧溶于水、甲醇、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、石油醚、二硫化碳，其多酚羥基基團與蛋白質(zhì)、金屬離子或者別的大分子如多糖可以生成復合物[1]，從而阻礙機體對蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，且具有苦澀味，影響適口性;高粱中單寧的含量是決定其品質(zhì)的重要指標。高粱單寧還具有潛在的健康益處，如自由基清除劑和化學保護劑[2-3]，是非常好的抗氧化劑源，有著各種各樣的用途。長期以來，人們發(fā)現(xiàn)含有單寧的高粱作為飼料使得動物消化效率降低，并對單胃動物(大鼠、豬、家禽等)的體質(zhì)量增加產(chǎn)生負面影響。飼料消化效率的降低主要歸因于高粱單寧-蛋白質(zhì)的絡(luò)合作用[4-5]。雖然單寧可使蛋白質(zhì)變得不易被人體吸收，但盲腸中的微生物可以將多聚單寧降解成小分子的酚酸，這些酚酸在盲腸中是可以被動物機體吸收的，同時單寧可以降低人對食物的消化速率，這一特性對Ⅱ型糖尿病的治療有一定的效果，還能夠結(jié)合營養(yǎng)物質(zhì)，降低食物的卡路里。

由于高粱單寧結(jié)構(gòu)比較復雜，定量測定相對來說較為困難，目前已經(jīng)使用許多分析方法來量化植物材料中的單寧[6]。常用的方法包括單寧的氧化解聚與芳香醛的反應(yīng)[7]，以及氧化還原反應(yīng)[8]，其他方法還涉及酸裂解反應(yīng)[9]，沉淀反應(yīng)[10]，酶和微生物抑制和質(zhì)量分析以及昂貴的核磁共振技術(shù)以及高壓液相色譜法[11]等。

作者主要從高粱單寧的結(jié)構(gòu)、分布、分離純化鑒定、測定檢測方法以及在測定高粱單寧含量過程中的影響因素等方面進行綜述。

1 高粱單寧的結(jié)構(gòu)

單寧根據(jù)結(jié)構(gòu)特性可以分為兩類：一類是水解單寧，另一類是縮合單寧。水解單寧是棓酸，或與棓酸有生源關(guān)系的酚羧酸與多元醇組成的酯，其分子內(nèi)的酯鍵在酸、酶或堿的作用下易水解，產(chǎn)生多元醇及酚酸。其中常作為高粱單寧含量測定標準品的單寧酸(圖1a)則為水解單寧。水解后生成一個葡萄糖分子及多個多元醇[12]?？s合單寧是多羥基黃烷-3-醇寡聚體或者多聚體，黃烷醇單體之間通過C—C鍵連接?？s合單寧又稱原花青素，由表兒茶素和兒茶素亞基組成，其主要通過C4→C8鍵連接的黃烷-3-醇單元組成低聚物和高聚物的混合物，也可能通過C4→C6鍵的連接，均稱為B型原花青素(圖1b)。黃烷-3-醇單元也可以通過C2→O7之間的醚鍵雙鍵連接，為A型原花青素(圖1c)[13]。從結(jié)構(gòu)上分析，高粱單寧屬于B型原花青素中的一種。有學者[14]采用正相HPLC-MS/MS方法，并利用硫解測定高粱中原花青素的平均聚合度(DP)為17.67±3.92。

圖1 單寧的結(jié)構(gòu)

2 高粱單寧的分布

高粱單寧主要分布在種皮上，胚乳中也有一定的含量，其具體含量因品種而異，變化幅度為0.2%～2.3%[15]，然而種皮顏色也并不完全是高粱單寧含量高低的可靠指示劑。Boren等[16]研究了不同種皮顏色的高粱中單寧的含量，結(jié)果表明，種皮顏色及其強度不是單寧含量的良好指標。人們一直錯誤地認為所有具有紅色/褐色種皮的高粱都含有單寧，其實無論白色、黃色、紅色或棕色種皮的高粱是否存在單寧主要取決于著色種皮基因的控制。Dykes等[17]根據(jù)它們的遺傳學和化學分析，將高粱品種劃分為3組：Ⅰ型高粱(b1b1B2-、B1-b2b2、b1b1b2b2)沒有色素種皮，含有低水平的酚類物質(zhì)而不含單寧；Ⅱ型高粱和Ⅲ型高粱均具有色素并含有單寧。Earp等[18]研究表明Ⅱ型高粱的單寧在種皮層中沉積不同。在Ⅱ型高粱的籽粒中，單寧沉積在種皮層內(nèi)的囊泡中，而Ⅲ型單寧沿著種皮的細胞壁沉積，有的存在于果皮中，這可以解釋為什么酸可以破壞囊泡的結(jié)構(gòu)，從而釋放Ⅱ型高粱中的單寧。

3 高粱單寧的提純分離與結(jié)構(gòu)鑒定

高粱中單寧的提取率與提取條件密切相關(guān)。高粱的貯存方式、干燥、粉碎度、提取溶劑、溫度等都可能導致單寧化學結(jié)構(gòu)的變化和提取率的改變，從而改變單寧的理化性質(zhì)和生物活性。

高粱單寧分離純化的方法主要有：溶劑萃取分離法、膜過濾法、層析法、制備液相色譜法等，其中層析法效果好，成本低，色譜填料主要有：NKA、ADS-17、Sephadex LH-20、硅膠柱及聚酰胺等[19]。Sephadex LH-20是一種對黃酮類化合物具有高度親和性的羥丙基化葡聚糖凝膠，目前多用于高粱單寧的純化和分離[20]，但是其價格昂貴，層析操作過程煩瑣，不利于實驗室的推廣應(yīng)用。

Strumeyer等[20]提出了提取分離高粱單寧的新方法：100 g高粱粉碎后，用無水乙醚(3×125 mL)脫脂，干燥后的樣品質(zhì)量為89 g，然后加入95%乙醇(2×125 mL)在25 ℃下提取1 h，離心取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得6.8 g固體。樣品干燥后，加載到葡聚糖LH-20(Sephadex LH-20)層析柱上，分別采用無水乙醇與50%丙酮溶液進行洗脫。結(jié)果表明，乙醇洗脫產(chǎn)物為非單寧多酚類物質(zhì)和部分低分子量單寧，而50%丙酮水洗脫產(chǎn)物則主要為高粱單寧。Awika等[14]研究了高粱中原花青素的提取與分離，該方法采用酸化70%丙酮進行單寧的提取，并利用高壓液相色譜法(HPLC)對高粱單寧的純度進行計算分析。Gu等[21]建立了一種正相HPLC-MS方法，可將原花青素分離為DP1～10，并且可以達到基線分離，DP>10的聚合物呈現(xiàn)一個大峰，并通過硫解測定了組成單元的比例和原花青素的平均聚合度[22]。

高粱單寧的浸提溶劑主要是對單寧有良好溶解能力的水合有機溶劑，少量水的存在能夠增加單寧在有機溶劑中的溶解度，不同比例的丙酮-水是最常用的提取溶劑。提取后的原料需要進一步分離和純化，但是過程較為困難，單寧有較大的分子量和強的極性，是許多結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)相似的復雜混合物，同時分離過程中可能發(fā)生氧化、解離等反應(yīng)，改變之前的結(jié)構(gòu)。雖然分離純化方法也在不斷優(yōu)化，但是過程還是十分費時且對儀器設(shè)備要求比較高，所以單寧的分離純化仍需不斷探索優(yōu)化。

4 高粱單寧的檢測方法

4.1 分光光度法

4.1.1 檸檬酸鐵銨比色法

檸檬酸鐵銨比色法是國際標準ISO 9648-1988《Sorghum-Determination of tannin content》以及國家標準GB/T 15686—2008《高粱 單寧含量測定》所采用的對高粱單寧的分析方法，其實驗原理是在堿性條件下高粱中的單寧與鐵離子形成一種棕色絡(luò)合物，用分光光度計在525 nm波長處測定其吸光度值，與標準系列比較定量。此方法存在的問題是所采用的提取溶劑為75%二甲基甲酰胺，其毒性相比于其他方法中的提取溶劑如丙酮、乙醇的毒性大，且不利于人體降解，操作過程需要做好防護措施。而作為標準品的單寧酸屬于可水解的沒食子單寧，而且在高粱中從未有檢測到單寧酸的存在[17]。King等[23]研究發(fā)現(xiàn)單寧酸是4個酚類物質(zhì)的混合物，其結(jié)構(gòu)與高粱單寧存在一定的差異性，但作為高粱單寧含量測定的標準品還有待進一步研究。

4.1.2 磷鉬酸比色法

磷鉬酸比色法是國家標準GB/T 27985—2011《飼料中單寧的測定—分光光度法》所采用的測定飼料中單寧含量的方法，其實驗原理是用丙酮溶液提取飼料中單寧類化合物，經(jīng)過濾后，取濾液加鎢酸鈉-磷鉬酸混合溶液和碳酸鈉溶液，顯藍色后在760 nm處有最大吸收波長，用單寧酸作標準曲線測定飼料中單寧含量。

磷鉬酸比色法中提取液的體積與高粱的品種有一定的關(guān)系。該法單寧含量在1 000 μg以下時，吸光度與單寧含量成直線關(guān)系。室溫下顯色25 min后顯色基本穩(wěn)定，并于3 h內(nèi)穩(wěn)定。此方法簡單快速，適合大量樣品分析測定。但是此方法受溫度影響較大，當室溫高于一定溫度時，顯色液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象, 使比色過程無法進行；室溫低于一定溫度時，又會出現(xiàn)在規(guī)定時間內(nèi)顯色液反應(yīng)不完全的現(xiàn)象，生成的不是藍色物質(zhì)，而是綠色反應(yīng)物，影響測定結(jié)果[24]。該方法作為測定植物中總酚的分析方法但不能區(qū)分高粱中非單寧多酚類物質(zhì)，測定結(jié)果可能高估高粱中單寧的含量。

4.1.3 香草醛法

香草醛法是基于香草醛與縮合單寧紅色復合物的生色反應(yīng)。香草醛檢測的關(guān)鍵因素有溶劑類型、酸濃度、反應(yīng)時間、溫度、香草醛濃度以及標準品的選擇[7]。

通常香草醛法使用兒茶素作為標準品，但是一般情況的反應(yīng)條件下兒茶素單體和相關(guān)的原花青素反應(yīng)動力學是不同的[25]。正是由于這個問題，建議使用內(nèi)標測定高粱單寧含量。香草醛法的另一個缺點是對單寧測定特異性較差，任何黃烷醇單體都能發(fā)生香草醛反應(yīng)[26];同時該法也缺乏對原花青素和原翠雀定敏感性[25]。Sun等[7]改進的香草醛法可以評估縮合單寧的分子量而不是定量總酚。

4.1.4 普魯士藍法

普魯士藍法可能是目前定量總酚最常用的方法，簡單、快速和不容易被非酚類化合物干擾[27-29]，但是測定高粱中單寧含量則缺乏特異性，結(jié)果存在偏高的可能性。它有兩個重要缺陷：一是在恒溫條件下一段時間后會產(chǎn)生沉淀，色密度隨時間延長而增加，溫度和pH值也是影響色密度的關(guān)鍵因素[15]；二是試劑加入的順序會影響普魯士藍所形成的顏色。

經(jīng)過Graham等[27]的綜合研究, H3PO4可用來保持顏色穩(wěn)定，降低pH值和絡(luò)合過量鐵離子。只要添加1%阿拉伯膠并放置60 h,可以避免沉淀來穩(wěn)定溶液[28-29]。試劑應(yīng)該按照順序加入：首先是樣品，然后為鐵氰化鉀試劑，接下來加入氯化鐵溶液，最后一步加入穩(wěn)定溶液的試劑。氧化還原反應(yīng)如下所示[30]：

酚類物質(zhì)+三價的鐵氰化離子→氧化酚+二價的鐵氰化離子，

二價鐵氰化離子+三價鐵離子→普魯士藍。

反應(yīng)時間和試劑濃度等反應(yīng)條件強烈影響不溶酚羥基基團的反應(yīng)性。這種測定將提供取代基活化酚基團的測量，這可能與單寧生物活性有很好的相關(guān)性。Budini等[8]描述了一個過程：非鄰位取代酚類物質(zhì)如苔蘚醇和間苯二酚反應(yīng)后沒有顏色產(chǎn)生，而具有一對鄰基或?qū)ξ环踊鶊F的基團近似地給出了相同的顏色，沒食子酸(有兩個鄰位酚類)[31]反應(yīng)后的顏色更深。該方法靈敏度較高，反應(yīng)快速并且可以節(jié)省物料，但是同樣的問題是難以通過顯色反應(yīng)區(qū)分其他酚類物質(zhì)與單寧的含量。

4.1.5 酸丁醇法

酸丁醇法具有悠久的歷史[25]，實驗原理是利用縮合單寧的酸催化氧化解聚來產(chǎn)生紅色花青素。Beart等[32]描述了使用該反應(yīng)來定量分析縮合單寧的方法。該方法存在以下限制和考慮因素：(1)據(jù)報道[33-34]，反應(yīng)介質(zhì)中水分含量在顏色形成中起到了重要作用。(2)酸在裂解黃烷醇鍵的難易程度上差異顯著，與通常黃烷醇間的4→8鍵相比，4→6鍵相對來說更不容易被酸裂解，同時A環(huán)取代基的性質(zhì)也影響酸裂解的能力[35]。(3)黃烷醇單體上的R基中的酚基團數(shù)影響最大吸光度的波長和花色素產(chǎn)物的消光系數(shù)，例如矢車菊素與飛燕草素最大吸收波長分別為545 nm和557 nm[36]。(4)Porter等[37]報道，F(xiàn)e3+是催化正丁醇-HCl反應(yīng)中形成顏色最有效物質(zhì)，是過渡金屬離子，推測過量的Fe3+抑制單寧解聚或降低花青素在相應(yīng)波長下的吸光度。由于反應(yīng)會產(chǎn)生不一致的顏色，導致一些研究人員停止使用金屬離子催化劑[38]。(5)還有一個重要的影響因素是體系中酸與丁醇的比例[26]，另外反應(yīng)溫度和時間也對反應(yīng)有非常重要的影響。(6)由于高粱單寧的異質(zhì)性和缺乏適當?shù)牧炕瘶藴?，標準品的選擇仍然是一個尚未解決的問題。

4.2 蛋白質(zhì)沉淀法

使用現(xiàn)代技術(shù)(包括競爭性結(jié)合方法和光譜方法)檢查單寧-蛋白質(zhì)相互作用,已經(jīng)清楚地證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在復合物形成中起重要作用。蛋白質(zhì)沉淀法主要是利用單寧和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)分離提純單寧，再將單寧溶解使其與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，并在510 nm波長下有最大吸收，其吸光值與單寧的含量在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系[39]，由此來定量單寧的含量。

Bate-Smith等[40]提出了一種基于單寧沉淀血紅蛋白的檢測方法。該方法操作比較困難，主要是由于該方法必須使用抽取的新鮮血液，而且皂苷和其他植物代謝物對單寧測定存在干擾[41]。Goldstein等[42]提出了一種基于單寧抑制β-葡萄糖苷酶酶活性的方法，但該方法實驗原理難以解釋，因為酶活性與形成的不溶性復合物之間結(jié)合的情況還有待進一步探索。

蛋白質(zhì)沉淀牛血清蛋白近年來使用較多，該方法操作相對簡單，方便快捷，適合實驗室操作[10]。胡立志等[43]采用了蛋白質(zhì)沉淀法對葡萄籽中的原花青素含量進行了測定，此法是基于牛血清蛋白和堿性磷酸酶的共沉淀作用，通過蛋白質(zhì)沉淀法很好地測量了單寧的含量，并驗證了方法的可行性，為實驗室提供了一種方便快捷的方法。

4.3 高壓液相色譜法

高壓液相色譜法可以定量分析高粱單寧含量，正相和反相高壓液相色譜方法已用于分離原花青素聚合物。反相高壓液相色譜法用于分離較低分子量的原花青素；正相高壓液相色譜法用于分離原花青素低聚物和多聚物，洗脫順序與聚合度一致；并且串聯(lián)MS已用于表征DP≤6(通常m/z50～2 000)的原花青素[44]。高壓液相色譜法準確度與精密度高，但是儀器價格昂貴，仍難于廣泛推廣應(yīng)用。

反相高壓液相色譜法常用的色譜柱主要是C18柱，流動相A為甲醇或者乙腈，流動相B主要是加酸水溶液，檢測器為紫外檢測器(UV)，檢測波長為280 nm。Jaworski等[45]利用反相C18Radial-PAK柱對葡萄中的酚類物質(zhì)進行了高壓液相色譜分析。流動相A為0.5%冰醋酸水溶液，B為40%乙腈水溶液，原花青素B1、兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的保留時間分別為9.4、13、15.6、20.2 min。

近些年來正相高壓液相色譜法應(yīng)用較多，在正相高壓液相色譜法中主要是基于聚合度分離原花青素的制備方法。Kelm等[13]進一步改進比較了5 μm硅膠柱(250 mm×4.6 mm)與5 μm二醇柱(250 mm×4.6 mm)對原花青素聚合度的分離效果，在相同色譜條件下保留特性存在顯著差異。在相同色譜條件以及相同梯度洗脫條件下，二醇柱分離到十聚體部分的保留時間比在硅膠柱上所觀察到的保留時間長約50%，說明二醇柱對原花青素的親和度較好，吸附能力較強，可以提高原花青素的分離效果。為了研究這種分離行為不是一個制造商所特有的，Robbins等[46]在相同流動相條件下檢查了5種二醇柱，其中根據(jù)聚合度分離的有4個柱子，結(jié)果表示二醇柱能達到一致的分辨率。其中Develosil Diol柱具有近似對稱的峰形和一致的分辨率，可以用于定量實驗的進一步檢驗和方法性能評價。HPLC法在定量高粱單寧的過程中，缺乏市售的標準品仍是一個尚未解決問題。

5 影響高粱單寧含量測定的因素

5.1 提取溶劑

單寧通常以結(jié)合態(tài)與蛋白質(zhì)、纖維素結(jié)合在一起[26]，一般不容易被提取出來。通常情況下采用有機溶劑進行單寧的提取，其具有斷裂氫鍵的作用，由于有機溶劑的滲透性比較差，一般采用水溶液作為傳遞介質(zhì)。有機溶劑體系主要分為丙酮水體系、乙醇水體系以及甲醇水體系等。樊金玲等[47]使用70%丙酮水溶液對原花青素進行提取，還有一些學者[32, 44, 48-49]則采用的是含2%甲酸的70%丙酮水溶液。乙醇是常用的提取溶劑，價格低廉，還可以回收利用，同時可以除去一些親水性物質(zhì)，金海英[50]，陸勝民等[51]，Cheynier[52]則分別利用70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇對單寧進行了提取，Adamson[11]采用70%甲醇以及Ajm[53]使用純甲醇對高粱單寧進行提取，發(fā)現(xiàn)無水甲醇更有利于隨后的純化與分析，但是甲醇不能完全提取單寧。ISO 9648、GB/T 15686—2008則是利用75%二甲基甲酰胺對高粱中單寧進行提取分離，但是二甲基甲酰胺毒性較強，進入人體后不容易降解，易污染環(huán)境。

5.2 樣品粒度

單寧提取樣品的粒度間接反映研磨和磨制的程度，在單寧測定過程中有很大的影響。然而，其效果似乎隨所測的樣品類型而變化，測定方法的差異也隨著顆粒大小的減小而更加明顯。高粱研磨時間的延長導致單寧的氧化損失，所以研磨過程中要注意高粱粉樣品在空氣中暴露的時間。

5.3 儲藏條件

由于高粱單寧容易氧化，高粱粉碎后暴露在空氣中或存放在陽光下，對單寧都有一定的影響。為了避免氧化損失，優(yōu)選在研磨后6～8 h內(nèi)對高粱單寧含量進行分析。

貯藏高粱籽粒的相對濕度對高粱中單寧的含量也會造成一定的影響。Mitaru等[54]研究在高濕度條件下貯藏的高單寧含量的高粱，與在正常條件下低單寧含量的高粱最終所測單寧含量相似。在研究的高濕度貯藏條件下的4個高粱品種中，發(fā)現(xiàn)單寧含量在貯藏前10 d內(nèi)下降最為明顯，然后在接下來的20 d內(nèi)下降到最低值。Davis[55-56]觀察到，隨著籽粒的成熟,高粱籽粒中單寧的含量逐漸下降，雖然在高水分貯藏條件下單寧失活的機理尚不完全清楚。Mitaru等[54]指出,該過程可能類似于種子成熟過程中單寧聚合的過程，在聚合過程中水分起到了一種傳質(zhì)作用。在這種介質(zhì)中，高粱單寧不斷聚合，一旦單寧聚合度大于10個黃烷單體就會變得高度不溶并難以測定。

5.4 標準品

由于高粱單寧的異質(zhì)性和缺乏適當量化標準，標準品的選擇仍然是一個尚未解決的問題。酚類化合物與不同試劑的摩爾反應(yīng)性的變化，也給高粱單寧分析參考標準的選擇帶來了額外的問題。單寧酸經(jīng)常被選擇為總酚分析中的標準品，主要原因可能是其與天然單寧有緊密結(jié)構(gòu)關(guān)系，但是單寧酸為典型的水解單寧，在高粱中也沒有發(fā)現(xiàn)單寧酸的存在。同時King等[23]發(fā)現(xiàn)單寧酸性質(zhì)會因樣品不同而變動。

Price等[57]用香草醛法研究了兒茶素和部分純化的縮合單寧的反應(yīng)動力學。雖然起始動力學行為非常相似，但在后期，兒茶素和縮合單寧的反應(yīng)動力學明顯不同，其研究還表明兒茶素作為參考標準在顏色、產(chǎn)量上高估了高粱單寧而且兒茶素的標準曲線偏離了線性度。根據(jù)所采用的方法，當兒茶素被用作標準時，高估值從1.2～4倍不等。顯然，香草醛分析中的反應(yīng)動力學對于單體和聚合黃烷是非常不同的，并且只有當天然聚合物用作參考標準時才能獲得真正的單寧定量估計值。

Kelm等[13]分析了二醇柱上的熒光檢測色譜峰，利用制備型HPLC從可可提取物中分離收集各個級分，分離得到了高純度的原花青素，以此作為分析過程中的標準品來進行高粱中原花青素含量的分析，這種方法能非常準確地測定高粱中單寧的含量。但是制備標準品對儀器要求較高、造價昂貴且不同來源的原料所制備的標準品也有很大差距，不利于實驗室的推廣應(yīng)用。

6 結(jié)論

高粱單寧具有復雜的化學結(jié)構(gòu)，定量分析比較困難。單寧主要分布在高粱種皮中，胚乳中也有一定的含量，其分離純化過程相對煩瑣，且不利于普遍推廣應(yīng)用。分光光度法仍在不斷優(yōu)化與發(fā)展，HPLC法雖繁瑣但能較為準確地定量單寧。無論是分光光度法還是HPLC法，目前仍面臨的問題是沒有市售的標準品，快速準確地檢測高粱中單寧含量的方法仍需不斷發(fā)展與優(yōu)化，以提高方法的準確性與特異性。