性別因素對蘇尼特羊背最長肌肌內(nèi)脂肪沉積的影響及相關(guān)性研究

高 棟，高愛琴，冀 祥，李 卿

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）

蘇尼特羊?qū)儆趦?nèi)蒙古綿羊系統(tǒng)中的一類，在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟大草原上經(jīng)過長期的自然生長與人工選擇培育而成，其產(chǎn)肉性能好，瘦肉率高，蛋白高、脂肪低，膻味輕，于1986 被批準為地方良種，1997 年被內(nèi)蒙古政府正式命名[1]。眾多研究認為最佳的肌內(nèi)脂肪（IMF）含量為2.0%～3.0%[2-5]，蘇尼特羊IMF 含量平均3.14%，表現(xiàn)出很好的肉品質(zhì)。肉品質(zhì)包括物理性參數(shù)和化學性參數(shù)，其中脂肪酸影響著肉的風味和抗氧化能力，而脂肪酸又受到基因、日糧、品種、性別、年齡等因素調(diào)控[6]。大部分對肉羊肉品質(zhì)影響的研究主要從飼喂方式、日糧和月齡等因素進行，本實驗則主要對性別因素對蘇尼特羊肉品質(zhì)造成的影響進行研究。本研究以6 月齡蘇尼特公母羊為實驗動物，研究性別因素對蘇尼特羊肌內(nèi)脂肪、脂肪酸沉積量、脂肪酸代謝基因mRNA 表達量和脂肪酸代謝酶活的影響，并對脂肪酸代謝基因表達量與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量、脂肪酸代謝酶活與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量進行相關(guān)性分析，為后期蘇尼特羊的脂肪沉積研究以及生產(chǎn)活動提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 在內(nèi)蒙古蘇尼特右旗改良站選取舍飼6月齡、體重35 kg 左右蘇尼特羊公、母各12 只。屠宰后，采取一部分背最長肌放入液氮中保存用于RNA 的提取，另一部分-20℃保存用于IMF 含量、脂肪酸、酶活的測定。

1.2 IMF 測定 采用索氏抽提法測定脂肪含量，將濾紙切成8 cm×8 cm，疊成一邊不封口的紙包，用硬鉛筆編寫順序號，按順序排列在培養(yǎng)皿中。將盛有濾紙包的培養(yǎng)皿移入（105±2）℃烘箱中干燥2 h，取出放入干燥器中，冷卻至室溫。按順序?qū)⒏鳛V紙包放入同一稱量瓶中稱重、稱量時室內(nèi)相對濕度必須低于70%。在上述已稱重的濾紙包中裝入3 g 左右研細的肉樣，封好包口，放入（105±2）℃的烘箱中干燥3 h，移至干燥器中冷卻至室溫。按順序號依次放入稱量瓶中稱重。將裝有樣品的濾紙包用長鑷子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67 倍的無水乙醚，使樣品包完全浸沒在乙醚中。連接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒溫水浴中進行抽提，調(diào)節(jié)水溫在70～80℃，使冷凝下滴的乙醚成連珠狀（120～150 滴/min 或回流7 次/h 以上），抽提至抽取筒內(nèi)的乙醚用濾紙點滴檢查無油跡為止（需6～12 h）。抽提完畢后，用長鑷子取出濾紙包，在通風處使乙醚揮發(fā)（抽提室溫以12～25℃為宜）。提取瓶中的乙醚另行回收。待乙醚揮發(fā)之后，將濾紙包置于（105±2）℃烘箱中干燥2 h，放入干燥器冷卻至恒重為止。

1.3 脂肪酸測定 稱取5 g 粉碎肉樣，參照Folch 等[7]的方法提取各組織中的總脂肪，加入5 mL 0.5 mol/L 的NaOH-CH3OH 溶液進行脂肪皂化（70℃、5 min），再加入5 mL 的BF3-CH3OH（1:3，V/V）溶液進行脂肪的甲酯化（70℃、2 min），最后加入3 mL C6H14萃?。?0℃、1 min），加入5 mL 飽和NaCl 溶液后靜置10 min，分層后吸1 mL 正己烷層于進樣瓶中進行氣相色譜分析。

1.4 背最長肌脂肪酸代謝基因mRNA 表達量的測定 采用實時熒光定量PCR 擴增技術(shù)檢測6 月蘇尼特母羊、公羊脂肪代謝關(guān)鍵基因心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）以及脂代謝關(guān)鍵酶基因乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）和脂蛋白酯酶（LPL）的mRNA 表達量。

1.4.1 引物設(shè)計與合成 以GAPDH為內(nèi)參基因，參考GenBank 綿羊的H-FABP、ACC和LPL基因引物序列，合成機構(gòu)為北京六合華大基因科技有限公司，-20℃保存。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.2 RNA 的提取 取待測組織樣在研缽中加液氮研磨至粉末狀，轉(zhuǎn)移到1.5 mL Free-RNase 離心管中，加入1 mL Trizol 溶液，振蕩混勻，在冰上靜置10 min，4 ℃ 12 000×g 離心5 min；取上清加入300 μL 氯仿（冰），振蕩混勻至充分乳化，冰上靜置10 min，4℃12 000 r/min 離心15 min；取上清加入等量異丙醇（冰），輕輕顛倒混勻，冰上靜置10 min，4℃ 12 000 r/min 離心15 min（此時會有羽毛狀沉淀）；棄上清，留沉淀，加入1 mL 75%冰乙醇，反復(fù)吹打使羽毛狀沉淀在溶液中飄蕩幾次4℃ 12 000 r/min 離心5 min；棄乙醇，留沉淀，晾干，加適量Free-RNase H2O 溶解。取部分檢測提取出的RNA 完整性和純度。

1.4.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 采用 TaKaRa RRO36A試劑盒于PCR 儀中合成cDNA，H-FABP、ACC、LPL反應(yīng)體系：5xPrime Script RT Master Mix 4 μL，Total RNA 2 μL，F(xiàn)ree-RNase H2O 14 μL，Total 20 μL。反應(yīng)條件：37℃轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5 s，4℃時結(jié)束，-80℃保存。

1.4.4 實時熒光定量PCR 采用 TaKaRa RR820A 試劑盒，在熒光定量儀中進行實時熒光定量測定，20 μL PCR 反應(yīng)體系：SYBR premix Ex Tap 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，模板（c DNA）2 μL，F(xiàn)ree-RNase H2O 6.4 μL。反應(yīng)程序：40 個循環(huán)，95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s。

1.5 背最長肌脂肪酸代謝相關(guān)酶活的測定 將背最長肌組織樣制成10% 組織勻漿，離心取上清待測。利用考馬斯亮藍法測出總蛋白，然后利用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A 羧化酶（ACC）、甘油三酯水解酶（ATGL）活性進行測定。

1.6 統(tǒng)計分析 利用Excel 2007 初步整理數(shù)據(jù)，用SAS統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標準差來表示，并以P＜0.05 為差異顯著性的評判標準。相關(guān)性分析用SPSS 22 進行Pearson 相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 性別因素對蘇尼特羊肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量的影響由表4 可以看出，性別因素對蘇尼特羊肌內(nèi)脂肪影響顯著。6 月齡蘇尼特公母羊飽和脂肪酸（SFA）主要以豆蔻酸（C14:0）、棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C16:0）為主，母羊豆蔻酸（C14:0）顯著高于公羊，公母羊之間棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）差異不顯著。單不飽和脂肪酸（MUFA）主要以豆蔻油酸（C14:1）、棕櫚油酸（C16:1）、油酸（C18:1）為主，其中母羊棕櫚油酸沉積量顯著高于公羊，其余2 種差異不顯著。多不飽和脂肪酸（PUFA）主要以亞油酸（C18:2）、亞麻酸（C18:3）、花生四烯酸（C20:4）為主，性別因素對3 種飽和脂肪酸沒有顯著影響。性別因素對總脂肪酸（FA）、SFA、不飽和脂肪酸（UFA）總量、P/S 值、U/S 值、n-6:n-3 比值影響均不顯著。

表4 6 月齡蘇尼特羊背最長肌肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量

2.2 性別因素對蘇尼特羊背最長肌中脂肪酸代謝基因mRNA 表達量的影響 表5 顯示，不同性別因素對脂肪沉積關(guān)鍵基因H-FABP、ACC有顯著影響，公羊背肌中脂肪沉積關(guān)鍵基因H-FABP的表達量與母羊相比下調(diào)49%（P＜0.05），ACC與母羊相比下調(diào)59%（P＜0.05）；性別因素對LPL影響不顯著。

表5 6 月齡蘇尼特羊背最長肌脂肪沉積相關(guān)基因的表達量

2.3 脂肪酸代謝基因表達量與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量相關(guān)性分析 由表6 可以看出，H-FABP基因與肌內(nèi)脂肪具有正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.76。H-FABP基因與豆蔻油酸、油酸、CLA、亞麻酸、花生四烯酸沒有相關(guān)性，與棕櫚油酸相關(guān)性（r=0.42）。ACC也與棕櫚油酸具有相關(guān)性（r=0.62），與其他飽和脂肪酸不具有相關(guān)性。

2.5 性別因素對蘇尼特羊脂肪酸代謝酶活的影響 由表7 得出，性別因素ACC 影響顯著，母羊ACC 的酶活顯著高于公羊。而性別因素對FAS、ATGL 酶活的影響不顯著。總體來看，母羊ACC、FAS、ATGL 3 種酶活高于公羊。

表6 蘇尼特羊背最長肌脂肪沉積相關(guān)基因與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸的相關(guān)性（n=12）

表7 蘇尼特羊背最長肌脂肪沉積相關(guān)酶的活性

2.7 脂肪酸代謝酶活與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸含量相關(guān)性分析 由表8 可以看出，ATGL 與肌內(nèi)脂肪呈負相關(guān)。FAS 與豆蔻油酸、棕櫚油酸、?-亞麻酸沒有相關(guān)性。但是與油酸、CLA 具有正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.41、0.43，與α-亞麻酸、花生四烯酸呈負相關(guān)，特別是與α-亞麻酸呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

表8 蘇尼特羊背最長肌脂肪沉積相關(guān)酶活與肌內(nèi)脂肪和脂肪酸的相關(guān)性（n=12）

3 討 論

肉中脂肪和脂肪酸含量是影響肉品質(zhì)的因素，也是被人類攝取以后是否對人類健康造成影響的重要指標[8]。羊肉中IMF 含量對羊肉的嫩度、風味以及大理石紋均有著重要的影響，也是影響羊肉品質(zhì)的重要因素之一[9]。衡量羊肉營養(yǎng)價值的指標有PUFA 與SFA 的比值（P:S）和n-6 PUFA 與n-3 PUFA 比值（n-6:n-3）[10]。本研究結(jié)果表明，公羊豆蔻酸含量顯著低于母羊，硬脂酸顯著高于母羊。公羊棕櫚油酸含量顯著低于母羊，棕櫚油酸在單不飽和脂肪酸中最具代表性，且是多不飽和脂肪酸合成的前體物質(zhì)，單不飽和脂肪酸在降低膽固醇和血糖方面具有重要作用[11]。脂肪代謝過程中，相關(guān)基因和酶活起重要調(diào)控作用。H-FABP對長鏈脂肪酸的攝取，維持細胞內(nèi)外脂肪酸濃度差以及脂肪代謝起到重要作用。ACC 是脂肪酸合成過程中的限速酶。LPL 是甘油三酯降解為甘油和游離脂肪酸反應(yīng)的限速酶，與機體的脂質(zhì)代謝及肥胖密切相關(guān)，若其含量過低，使得脂蛋白無法分解，體內(nèi)脂質(zhì)因不能分解利用而沉積導(dǎo)致肥胖[12]。FAS是脂肪酸從頭合成過程中的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS 的高水平表達能夠促進甘油三酯在體內(nèi)的沉積從而導(dǎo)致肥胖[13]。ATGL 是水解甘油三酯的關(guān)鍵酶，將甘油三酯水解為甘油二酯。本研究發(fā)現(xiàn)，性別差異導(dǎo)致H-FABP、ACC表達量差異顯著，母羊的表達量顯著高于公羊，而性別因素對LPL、FAS、ATGL沒有影響。在相關(guān)性分析中，H-FABP與IMF 呈正相關(guān)，也就是說H-FABP對脂肪沉積起到正向調(diào)控作用。同時母羊的IMF 含量顯著高于公羊。這也證實了在性別因素的影響下母羊H-FABP表達量高于公羊這一結(jié)論是正確的。本研究發(fā)現(xiàn)，性別因素對蘇尼特羊脂肪沉積、脂代謝基因表達量有一定程度的影響；ATGL 活性與肌內(nèi)脂肪呈負相關(guān)，F(xiàn)AS 活性與油酸和CLA 含量呈正相關(guān)，油酸是合成飽和脂肪酸的前體物質(zhì)[14]，CLA 更是在生理上具有抗動脈粥樣硬化、抗癌、抗腫瘤等重要作用[15]，這為后續(xù)的研究工作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，性別因素對蘇尼特羊H-FABP、ACC表達量及酶活影響顯著，并對IMF 影響顯著，母羊顯著高于公羊；在相關(guān)性分子中，脂肪沉積關(guān)鍵基因H-FABP與IMF 呈正相關(guān)，對肌內(nèi)脂肪的沉積具有正向調(diào)控作用；FAS 對油酸和CLA 具有正向的調(diào)控作用。