用于牛奶中三聚氰胺測(cè)定的紙芯片研究

呂聰聰 張 柳 侯 越 劉 偉

(陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院、陜西省生命分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710119)

0 引言

三聚氰胺(C3H6N6)中的含氮量非常高(通常按照質(zhì)量計(jì)為66.6%)，且有成本低的[1]特性.近年來(lái)，三聚氰胺被非法添加在嬰幼兒配方奶粉、牛奶和寵物食品中，在檢測(cè)時(shí)，其蛋白質(zhì)的含量可以高于我們用凱氏定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量，使消費(fèi)者被誤導(dǎo).而這些產(chǎn)品在奶制品市場(chǎng)上獲得廉價(jià)的價(jià)格.但三聚氰胺在和它的水解產(chǎn)物三聚氰酸結(jié)合后，卻造成腎小管中不溶性結(jié)晶生成，這可能會(huì)使腎功能衰竭[2].因此，奶制品和其它食品中三聚氰胺的量需要嚴(yán)格控制.我國(guó)政府規(guī)定，三聚氰胺在嬰幼兒食品和其它食品中的最大允許殘留量分別為1.0 mg/kg和2.5 mg/kg[3].目前測(cè)定三聚氰胺含量的主要方法有色譜法[4]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、電化學(xué)法[6]、表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法[7,8]、熒光光譜法[9,10]，比色法[11]等.

而在這些檢測(cè)方法中，目視比色法具有簡(jiǎn)單、快速、可適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及易普及的特點(diǎn)而引起人們的廣泛關(guān)注.在納米金比色法中，2011年前后，酶聯(lián)免疫分析和膠體金免疫層析試紙[12]是主要的檢測(cè)方法.通過(guò)合成未修飾或修飾過(guò)的Au納米粒子，利用其與三聚氰胺發(fā)生團(tuán)聚顯色而發(fā)展了一系列的納米金測(cè)定三聚氰胺含量的目視比色法[13,14].在近三年的研究中，利用其他方法修飾或適配體功能化的納米金及未修飾的納米銀[15-18]，也達(dá)到對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的目的.但膠體金免疫層析試紙會(huì)涉及到噴金等操作，實(shí)驗(yàn)成本比較高，將納米粒子滴涂在紙上會(huì)使其團(tuán)聚，因此發(fā)展納米粒子測(cè)定的紙芯片具有一定的難度.在利用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-H2O2顯色體系[22-26]來(lái)檢測(cè)三聚氰胺的相關(guān)工作中，一般實(shí)驗(yàn)孵育時(shí)間比較長(zhǎng)，且需要加熱等操作，因此發(fā)展孵育時(shí)間短的TMB顯色體系有一定的優(yōu)勢(shì).近年來(lái)，紙芯片[19-21]以其具有成本低、易操作、可攜帶等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注.本文旨在建立一種紙上測(cè)定三聚氰胺的快速測(cè)定方法，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)- TMB- H2O2顯色體系[27-29]為基礎(chǔ)，利用三聚氰胺可以使該顯色體系的顯色增強(qiáng)的現(xiàn)象，建立了一種比色法測(cè)定三聚氰胺的紙芯片.該顯色方法不需加熱等操作，室溫孵育5 min即可測(cè)定，反應(yīng)所需的試劑量很少，且具有即用即拋、不會(huì)產(chǎn)生樣品交叉污染的特點(diǎn).該方法測(cè)定三聚氰胺的檢出限為5 μM，可實(shí)現(xiàn)牛奶樣品中的三聚氰胺含量的快速測(cè)定.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：富士施樂(lè)蠟打印機(jī)(8570，富士施樂(lè)有限公司，美國(guó))；佳能數(shù)碼相機(jī)(Canon EOS 550D，日本)；TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1800，日本島津儀器有限公司).

試劑及材料：Whatman 1號(hào)濾紙(200.0 mm×200.0 mm，Sigma)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)(上海雪滿(mǎn)生物科技有限公司)(純度：R.Z>3.1%)；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(北京索萊寶科技有限公司)(純度：>98%)；過(guò)氧化氫(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)(純度：AR)；牛奶樣品購(gòu)于本地超市，試劑用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2 紙芯片的制作

采用文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的蠟打印法制作紙芯片[21,30,31]，首先用CorelDRAW X5畫(huà)圖軟件設(shè)計(jì)直徑為6 mm的紙芯片微區(qū)域，將設(shè)計(jì)的紙芯片按DXF格式保存后用切割控制軟件(ROBO Master-Pro)打開(kāi)后，將紙張放在模型版上，用切割機(jī)(Graphtec Craft Robo-S)切出所要的圖形，將設(shè)計(jì)好的圖案用蠟打印機(jī)打印，將打印好的紙芯片放在烘箱中，在150 ℃下加熱150 s，蠟圈在高溫下會(huì)融化并且滲透到紙纖維的內(nèi)部，這樣就會(huì)在紙芯片上形成疏水區(qū)域.

1.3 儲(chǔ)備液的制備

20.0 mM 的TMB的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0480 g粉末狀的TMB，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，渦旋振蕩 1 min，超聲15 min.避光保存，備用.

1.0 mM三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備: 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0126 g的三聚氰胺，用超純水溶解后轉(zhuǎn)移定容至100 mL.使用時(shí)逐級(jí)稀釋.

1.4 三聚氰胺的檢測(cè)

將1.6 μL的濃度為1.2 μM的HRP，3.0 μL 濃度為7.0 mM的TMB及2 μL的濃度為 0.7 mM的H2O2按順序滴加到直徑為6 mm的紙芯片上，室溫反應(yīng)5 min.作為對(duì)照組.按上述同樣的方法，最后再將1.0 μL不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到紙芯片上，室溫反應(yīng)5 min.以三聚氰胺的濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)強(qiáng)度 (加入三聚氰胺前后，所測(cè)灰度的變化) 為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(xiàn).

1.5 市售牛奶樣品處理

參照文獻(xiàn)[32]的方法對(duì)市售牛奶處理.分別取5.0 mL牛奶(牛奶樣品1，牛奶樣品2，牛奶樣品3)，加入 1.5 mL 2.0 M的三氯乙酸，渦旋振蕩1min，超聲處理10 min后，混合物以 13000 r/min 離心 10 min.取上清液過(guò)濾，用1 mol/L Na2CO3調(diào)至pH 8.0，再以 3000 r/min 離心3 min，取上清液，待用.

2 結(jié)果與討論

2.1 比色法檢測(cè)三聚氰胺的原理

實(shí)驗(yàn)中考查了HRP-TMB-H2O2及三聚氰胺加入該體系中的紫外可見(jiàn)吸收曲線(xiàn)，如圖1所示，HRP-TMB-H2O2溶液呈淺藍(lán)色(插圖a)，吸收光譜為圖1 中黑線(xiàn)，652 nm可產(chǎn)生特征吸收峰.向HRP-TMB-H2O2溶液中加入三聚氰后，溶液的顏色加深，變?yōu)檩^深的藍(lán)色(插圖 b)，652 nm處的吸收強(qiáng)度增加，且吸收位置不變 ( 圖1，紅線(xiàn))，并未出現(xiàn)新的吸收帶.HRP催化H2O2氧化TMB成為ox-TMB而顯藍(lán)色，在HRP-TMB-H2O2體系中添加三聚氰胺前后，吸收強(qiáng)度有所增加，是因?yàn)槿矍璋房梢蕴岣哌^(guò)氧化物酶的催化速度[33]，在同樣時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)速度加快，在立即添加三聚氰胺后，使同一時(shí)間點(diǎn)顏色加深，表明反應(yīng)中三聚氰胺可以增強(qiáng)HRP-TMB-H2O2的顯色反應(yīng)，起到催化的作用，并沒(méi)有新的物質(zhì)產(chǎn)生.

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系的影響

對(duì)于TMB顯色體系，顯色時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，因此首先考察顯色時(shí)間的影響.在TMB、H2O2和HRP的濃度為7.0 mM、0.7 mM和1.2 μM時(shí)，在室溫條件下，用一定濃度的三聚氰胺，測(cè)定了1-11 min內(nèi)顯色反應(yīng)的相對(duì)強(qiáng)度變化值，結(jié)果如圖2(a)所示，當(dāng)顯色時(shí)間達(dá)到5 min 時(shí)，反應(yīng)具有最佳的顯色效果.因此，選擇顯色反應(yīng)時(shí)間為5 min.

2.3 pH對(duì)體系的影響

已有研究表明，pH對(duì)實(shí)驗(yàn)顯色反應(yīng)的效果起著重要作用[11]，當(dāng)pH值低于3時(shí)，會(huì)影響到TMB-H2O2的性質(zhì)，反應(yīng)受到抑制.然而，如果pH過(guò)高，HRP會(huì)失活.因此在pH為3.0-7.0的范圍內(nèi)考察了pH對(duì)該顯色反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2(b)所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該體系在pH為4.5時(shí)體系有最佳的顯色效果.

2.4 HRP、TMB、H2O2濃度對(duì)體系的影響

為了在最佳的顯色體系下檢測(cè)三聚氰胺，HRP、TMB、H2O2的濃度也需要優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果如圖2(c)-(e)所示.在pH為4.5，反應(yīng)時(shí)間為5 min，TMB濃度為7.0 mM、H2O2濃度為0.7 mM的條件下，在0.1-1.5 μM濃度范圍內(nèi)考察了HRP對(duì)顯色體系的影響.隨著HRP的濃度0.2-1.2 μM不斷增大，所測(cè)的相對(duì)強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)濃度大于1.2 μM時(shí)，相對(duì)強(qiáng)度逐漸減小，所以在以后的實(shí)驗(yàn)中，選擇1.2 μM的HRP，結(jié)果如圖2(c)所示.

在pH為4.5，反應(yīng)時(shí)間為5 min，HRP濃度為1.2 μM、H2O2濃度為0.7 mM的條件下，在1-10 mM濃度范圍內(nèi)考察了TMB對(duì)顯色體系的影響.隨著TMB的濃度從1.0 mM到7.0 mM不斷增大，所測(cè)的相對(duì)強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)濃度大于7.0 mM時(shí)，相對(duì)強(qiáng)度逐漸減小，所以在以后的實(shí)驗(yàn)中，選擇7.0 mM的TMB，結(jié)果如圖2(d)所示.

在pH為4.5，反應(yīng)時(shí)間為5 min，HRP濃度為1.2 μM、TMB濃度為7.0 mM的條件下，在0.1-1.0 mM濃度范圍內(nèi)考察了H2O2對(duì)顯色體系的影響.隨著H2O2的濃度從0.1 mM到0.7 mM不斷增大，所測(cè)的相對(duì)強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)濃度大于0.7 mM時(shí)，過(guò)氧化氫的分解對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，會(huì)使測(cè)定的相對(duì)強(qiáng)度逐漸減小，所以在以后的實(shí)驗(yàn)中，選擇0.7 mM的H2O2，結(jié)果如圖2(e)所示.

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

為了將本方法用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，考察了牛奶中可能出現(xiàn)的物質(zhì)[11]對(duì)三聚氰胺測(cè)定的影響.在上述所選的最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，即HRP的濃度為1.2 μM，TMB的濃度為7.0 mM，H2O2的濃度為0.7 mM，pH值為4.5這一條件下，進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)的測(cè)定.

在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中三聚氰胺的含量相等，進(jìn)行干擾測(cè)定的實(shí)驗(yàn)組中逐一添加各干擾物，當(dāng)干擾物質(zhì)的濃度為三聚氰胺濃度的20倍時(shí)(實(shí)驗(yàn)中三聚氰胺的濃度為100 μM，其它物質(zhì)濃度均為2 mM)，測(cè)其相應(yīng)強(qiáng)度，再與對(duì)照組中只有三聚氰胺的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)基本相當(dāng)，說(shuō)明該反應(yīng)體系對(duì)三聚氰胺測(cè)定時(shí)，其他物質(zhì)并不會(huì)明顯的增加或者減弱響應(yīng)信號(hào)，所以結(jié)果表明，20倍的Zn2+、K+、Ca2+、乳糖、葡萄糖、半胱氨酸、賴(lài)氨酸、甘氨酸、維生素C和胸腺嘧啶均不會(huì)影響牛奶中三聚氰胺的測(cè)定.

1.6 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制及線(xiàn)性分析

在所選擇的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，本研究利用比色法，通過(guò)觀(guān)察紙芯片顏色的變化與三聚氰胺的濃度存在一定的線(xiàn)性關(guān)系，將紙芯片的顏色利用Image-J軟件處理轉(zhuǎn)化成灰度，在添加三聚氰胺前后灰度的差值即為相對(duì)強(qiáng)度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)強(qiáng)度值與三聚氰胺的濃度在10 μM-1.0 mM呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系.為了獲得更好的線(xiàn)性關(guān)系，我們采用分段線(xiàn)性的方法.針對(duì)10 μM -100 μM 和100 μM-1.0 mM兩個(gè)不同的線(xiàn)性范圍，線(xiàn)性回歸方程分別為y=15.7x+19.7 (R2=0.9933)和y=4.7x+26.3 (R2=0.9843) (其x單位為10-4M) 如圖4所示.隨著三聚氰胺濃度的增大，其相對(duì)強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng).對(duì)不同濃度梯度的三聚氰胺進(jìn)行了5次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1 %.

表1 三聚氰胺檢測(cè)各比色方法的對(duì)比

該方法的檢出限為5 μM，且選取幾種不同的比色方法從檢出限，線(xiàn)性，反應(yīng)條件，所用方法這幾個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比，該研究所需時(shí)間短，不需加熱，并列表對(duì)其檢出限進(jìn)行對(duì)比，如表1所示.

2.7 樣品加標(biāo)回收測(cè)定

為了評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)方法的可靠性和實(shí)用性[34-36]，我們將本方法用于測(cè)定牛奶中三聚氰胺的含量.將一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到樣品溶液中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示，觀(guān)察樣品溶液中加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品前后的回收率變化，結(jié)果表明該方法可靠且本方法可以用于實(shí)際牛奶樣品的檢測(cè).

表2 三聚氰胺加標(biāo)回收樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究在紙芯片上利用HRP-TMB-H2O2顯色體系成功實(shí)現(xiàn)了牛奶中的三聚氰胺含量的檢測(cè)，未加入三聚氰胺時(shí)，紙芯片呈現(xiàn)淺藍(lán)色，加入三聚氰胺后，顯色反應(yīng)增強(qiáng)，基于上述現(xiàn)象，以紙芯片為反應(yīng)載體，通過(guò)比色法可以建立快速測(cè)定三聚氰胺的比色分析方法.該方法測(cè)定三聚氰胺的檢出限為5 μM.由于紙芯片具有反應(yīng)所需的試劑量很少、即用即拋及樣品不會(huì)交叉污染的特點(diǎn)，因此該方法開(kāi)辟了一種簡(jiǎn)單快速、低成本的紙上檢測(cè)三聚氰胺新途徑.