利用SSR技術(shù)快速鑒定2個辣椒雜交品種純度

陳琛 羅俊杰 陳衛(wèi)國

摘要：利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對辣椒雜交種甘科4號和甘科10號及其父母本進(jìn)行引物篩選和純度鑒定，旨在建立供試品種的高效純度鑒定體系，并對公布的辣椒SSR核心引物進(jìn)行驗證。結(jié)果表明， 2個品種各篩選出1對引物在親本間有明顯差異，在雜交種中表現(xiàn)為共顯性，分別為Es330和Epms923。利用這2對引物分別對供試品種進(jìn)行純度鑒定，甘科4號的純度為96.4%，與田間種植鑒定純度98.2%相差1.8百分點(diǎn);甘科10號的純度為91.8%，與田間種植鑒定純度92.7%相差0.9百分點(diǎn)。說明篩選出的2對引物對甘科4號和甘科10號種子純度的鑒定結(jié)果真實(shí)可靠，可以用于雜交種純度的高效快速鑒定。

關(guān)鍵詞：辣椒; SSR分子標(biāo)記;純度鑒定

Abstract：In this study，pepper hybrid cultivars Ganke 4、Ganke 10 and their parental inbred lines were used to identify hybrid purity by SSR markers， aiming at establishing a quick and efficient purity identification system for tested varieties， verifying? the published pepper SSR core primers at the same time. The results showed that there was one primer pair selected in each cultivars，named Es330 and Epms923， which had significant difference between the parental inbred lines， and showed co-dominance in the hybrids. Using the two primer pairs to identify the purity of the tested varieties，the purity of Ganke 4 was 96.4%， which had 1.8 percentage point difference from the purity of 98.2% identified in field. the purity of Ganke 10 was 91.8%，which had 0.9 percentage point difference from the purity of 92.7% by field identification. It was proved that the identification of hybrid purity of Ganke 4 and Ganke 10 were authentic and reliable， the two SSR markers could be used for efficient and rapid identification of hybrid purity.

辣椒（Capsicum annuum L.）在中國每年的種植面積超過200萬hm2，是中國栽培面積最大的蔬菜作物之一[1 ]。生產(chǎn)上使用的大多數(shù)品種為雜交一代。中國的辣椒雜交育種的研究始于20世紀(jì)70年代，培育出了許多優(yōu)良品種，如早豐1號、湘研系列、杭椒1號、隴椒2號等[2 ]。雜交品種能整合親本的優(yōu)良基因，顯著提高辣椒產(chǎn)量、質(zhì)量及抗病抗逆性。但辣椒是常異花授粉植物，在雜交種子生產(chǎn)過程中常因隔離區(qū)不好、去雄不徹底、風(fēng)媒蟲媒傳粉等原因?qū)е路N子混雜，使品種的純度和真實(shí)性下降。

目前鑒定種子純度的常用方法有田間形態(tài)鑒定法、同工酶電泳技術(shù)、種子貯藏蛋白電泳技術(shù)和DNA分子標(biāo)記鑒定法[3 ]。田間形態(tài)鑒定要經(jīng)歷一個植物學(xué)生長周期，耗時長，成本高，且易受到栽培環(huán)境、氣候因素影響，對鑒定人員的要求也較高，需要鑒定者有豐富的工作經(jīng)驗，熟悉鑒定品種及其親本的植物學(xué)性狀差異和親子間的遺傳特性等;其次，由于部分骨干親本的頻繁使用使育成品種間的差異也逐漸縮小，僅根據(jù)外觀形態(tài)難以準(zhǔn)確區(qū)分不同品種間的差異。同工酶具有組織特異性，多態(tài)性較低，且酶易失活，對操作的要求較為嚴(yán)格。蛋白質(zhì)電泳是基于種子貯藏蛋白的多樣性通過電泳加以區(qū)分，但當(dāng)品種數(shù)量較多，親緣關(guān)系相近時難以鑒別[4 ]。SSR（Simple sequence repeat）是一類可遺傳的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，通常由1～6個核苷酸串聯(lián)重復(fù)組成，是一種常用的分子標(biāo)記。除了操作簡便、多態(tài)性高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，SSR標(biāo)記呈共顯性遺傳，可以用以區(qū)分純合體和雜合體，是雜交種純度鑒定的理想手段，也是目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)[5 ]。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于西瓜[6 ]、油菜[3 ]、玉米[7 ]、馬鈴薯[8 ]等農(nóng)作物種子純度的鑒定上，并且被證實(shí)是一種高效、可靠的方法。我們選取辣椒雜交一代品種甘科4號和甘科10號及其父母本為材料，應(yīng)用NY/T 2475-2013 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中報道的22對辣椒SSR核心引物對以上2個品種進(jìn)行純度鑒定，初步建立甘科4號和甘科10號種子純度的SSR檢測體系，并對標(biāo)準(zhǔn)中公布的核心引物的有效性進(jìn)行驗證。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試?yán)苯冯s交種甘科4號、甘科10號及親本材料均由甘肅綠星農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司選育并提供。每品種選取飽滿種子120粒，于2019年5月均勻播種在育苗盤中，長出2片真葉時隨機(jī)選取110株幼苗剪下葉片提取DNA。同時在塑料大棚內(nèi)種植2個供試品種材料各100株以上進(jìn)行田間種植鑒定。將SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 基因組DNA提取? ? SSR標(biāo)記引物篩選所使用的DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取，提取完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 測定DNA樣品的濃度和質(zhì)量，將DNA稀釋至50 ng/μL ，保存在-20 ℃冰箱備用。雜交種純度鑒定所用的DNA參照Weigel的DNA快速提取法[9 ]，所提DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測，保存于4 ℃冰箱備用。所用試劑包括Tris-HCl（pH 7.5）、NaCl、EDTA、SDS、異丙醇等。

1.2.2? ? SSR引物篩選? ? 根據(jù)NY/T 2475-2013 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中公布的辣椒SSR核心引物序列合成引物22對，由西安擎科生物技術(shù)有限公司合成。以甘科4號和甘科10號及各自親本DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選在父母本中有差異且在雜交種中表現(xiàn)為共顯形的引物。PCR反應(yīng)體系15 μL，由2×taq MasterMix 7.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L ）各0.6 μL、ddH2O 5.3 μL組成。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。退火溫度根據(jù)每對引物的Tm值設(shè)置。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后拍照記錄。

1.2.3? ? SSR標(biāo)記鑒定種子純度? ? 以每個品種單株DNA110份和親本DNA為模板，用篩選出的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果計算雜交種純度。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?SSR引物的篩選

經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，甘科4號和甘科10號2個辣椒品種各有1對引物Es330 和Epms923在親本間有明顯差異，且在F1代雜交種中表現(xiàn)為共顯形。引物Es330可以鑒定甘科4號（圖1D），引物Epms923可以鑒定甘科10號（圖1E）。其余引物大致可分為以下幾種：在父、母、子代中均具有無差異條帶（圖1A）;在父、母本中分別擴(kuò)增出不同的條帶，而在子代中擴(kuò)增出的條帶與父母本中一方相同（圖1B）;在父、母本中擴(kuò)增出的條帶無差異，而在子代中擴(kuò)增出不同的條帶（圖1C）。Es330和Epms923的序列及PCR程序見表1。

2.2? ?雜交種純度鑒定

用篩選出的兩對SSR引物分別對甘科4號和甘科10號的110個單株DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增鑒定純度。引物Es330對甘科4號的鑒定結(jié)果（圖2）所示，第75、106號單株的條帶與母本一致，屬于母本特異譜帶;第92號單株的條帶與父本帶型一致，屬父本特異譜帶;第37號單株既無母本條帶也沒有父本條帶，其余的106個單株都具有父母本雜合條帶，種子純度為96.4%。

引物Epms923對甘科10號的鑒定結(jié)果圖3所示，表現(xiàn)為母本特異譜帶的單株有第16、19、26、37、54、79、85、90號，共8株。第52號單株既無母本特異條帶也沒有父本特異條帶，應(yīng)為混雜的其他品種種子。沒有檢測到只具有父本特異條帶的單株。其余101個單株具有雙親雜合條帶，種子純度為91.8%。電泳結(jié)果統(tǒng)計見表2。

2.3? ?田間種植純度鑒定與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果比較

田間種植鑒定在最佳鑒定時期（果實(shí)成熟期）進(jìn)行，此時辣椒鑒定品種特有的植物學(xué)性狀已完全表現(xiàn)出來，便于準(zhǔn)確鑒定。主要依據(jù)鑒定品種的植物學(xué)性狀表現(xiàn)（植株高矮、莖節(jié)顏色、葉片長寬比、花器顏色、果實(shí)縱橫徑及比例、果實(shí)形狀及顏色、果面皺褶多少等）。進(jìn)行形態(tài)學(xué)差異鑒別，將田間種植鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果進(jìn)行對比，2個品種的鑒定結(jié)果偏差分別為1.8、0.9百分點(diǎn)（表3）。

3? ?結(jié)論與討論

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對辣椒雜交種甘科4號和甘科10號及其父母本進(jìn)行引物篩選和純度鑒定，并對公布的辣椒SSR核心引物進(jìn)行驗證。結(jié)果表明， 2個品種各篩選出1對引物在親本間有明顯差異，在雜交種中表現(xiàn)為共顯形，分別為Es330和Epms923。利用這2對引物分別對供試品種進(jìn)行純度鑒定，甘科4號的純度為96.4%，與田間種植鑒定純度98.2%相差1.8百分點(diǎn);甘科10號的純度為91.8%，與田間種植鑒定純度92.7%相差0.9百分點(diǎn)。說明篩選出的2對引物對甘科4號和甘科10號種子純度的鑒定結(jié)果真實(shí)可靠，可以用于雜交種純度的高效快速鑒定。

辣椒雜交種生產(chǎn)通常采取蕾期人工去雄雜交授粉完成，造成種子不純的原因主要有去雄不徹底導(dǎo)致母本自交、由于風(fēng)媒蟲媒等原因?qū)е履副颈环歉副镜幕ǚ畚廴?、機(jī)械或人為疏漏導(dǎo)致種子混雜。從試驗結(jié)果來看，2個品種的不純單株大部分是母本自交后代，說明造成種子不純的最主要原因為去雄不徹底形成的母本自交種。這與李淑紅等[10 ]對3個辣椒品種鑒定純度得出的結(jié)論一致。SSR鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果的純度偏差在2個品種中均小于2%，說明利用分子標(biāo)記鑒定辣椒雜交種子純度是一種準(zhǔn)確、可靠的方法，也證明了本文采用的引物來源NY/T 2475-2013 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有效性。

本試驗對每個品種只用了1對SSR引物進(jìn)行鑒定，結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果相近。劉子記等[11 ]利用3對SSR標(biāo)記對熱辣2號雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果顯示3對標(biāo)記的鑒定結(jié)果完全一致，并且與田間鑒定的結(jié)果也完全一致;楊雙娟等[12 ]用2對引物鑒定了豫椒101雜交種的純度，結(jié)果只相差0.5%，近乎一致。這些研究結(jié)果表明，單對SSR引物就可以對雜交種純度進(jìn)行鑒定。但是，也有研究中發(fā)現(xiàn)，并非所有引物都具有這樣的準(zhǔn)確性。傅鴻妃等[1 ]利用2對引物用于杭椒新品種H12的純度鑒定，結(jié)果分別為95.8%和89.6%，田間鑒定結(jié)果為94.5%，存在較大偏差。Sundaram 等[13 ]利用多對SSR引物用于雜交水稻的純度鑒定，指出多對引物比單對引物的檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。因此在純度鑒定時選擇合適的SSR引物十分重要。

分子標(biāo)記相關(guān)試驗中，通常需要大批量提取DNA。常用的DNA提取方法一般采用CTAB法或使用試劑盒，不僅耗時耗力，且后者成本較高。本文采用的DNA提取方法，是在Weigel的SDS快速提取植物DNA方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，無須使用液氮研磨和氯仿、PVP、異戊醇等有毒化學(xué)試劑，且經(jīng)后續(xù)試驗檢測DNA的質(zhì)量也較好。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)短時間大批量植物DNA樣本的制備，為SSR分子標(biāo)記試驗提供了極大便利。

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（本文責(zé)編：楊? ? 杰）