仔豬大腸桿菌性腹瀉病的病原分離鑒定

徐海生

（赤峰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 024000）

大腸桿菌（Escherichia coli）又稱大腸埃希氏菌，是食品衛(wèi)生安全評價(jià)中重要的指標(biāo)菌，普遍存在于人和動物腸道內(nèi)，對人和動物具有致病性，常引起嚴(yán)重的敗血癥和腹瀉[1]。 仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的仔豬消化道傳染病， 是一種條件性致病菌，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中多因陰冷潮濕、保溫不好、溫差過大、轉(zhuǎn)群換料導(dǎo)致仔豬發(fā)病和死亡，發(fā)病率和死亡率均較高。 在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，由于抗生素的不規(guī)范和盲目使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥譜不斷擴(kuò)大［2］，給豬大腸桿菌病的治療和控制帶來困難，同時(shí)對人類健康及公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。 為了解赤峰地區(qū)仔豬大腸桿菌流行情況， 本研究從赤峰地區(qū)3 個(gè)規(guī)?；i場采集了發(fā)生腹瀉的仔豬腸道內(nèi)容物，對本地區(qū)流行的血清型進(jìn)行了分析，旨在為該地區(qū)仔豬大腸桿菌病的預(yù)防及細(xì)菌耐藥性研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 材料

1.1.1 病料

赤峰市3 個(gè)規(guī)模化豬場收集仔豬腹瀉肛門拭子，共99 個(gè)樣本。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

單價(jià)血清：“O”抗原單價(jià)血清（批號：20170201），產(chǎn)自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司，革蘭氏染色液，麥康凱瓊脂，營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯，三糖鐵培養(yǎng)基（TSI），糖發(fā)酵管，MR 試劑，VP 試劑，靛基質(zhì)試劑。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

53 只清潔級BALB/c 小鼠（體重18～23g，雌雄各半）。購買自北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

將采集的99 只肛門拭子棉簽放入2mL 無菌生理鹽水中浸泡5min，取0.2mL 含有病原的生理鹽水接種在5mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，觀察試管內(nèi)菌液特征。 用接種環(huán)挑取渾濁菌液，接種在麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48h［4］，觀察菌落特征。

1.2.2 分離菌染色鏡檢

觀察麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基菌落， 紅色菌落為疑似大腸桿菌，用接種環(huán)挑取疑似菌落進(jìn)行涂片，采用革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體特征。 同時(shí)對疑似菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.3 生化實(shí)驗(yàn)

利用糖發(fā)酵試驗(yàn)（包括：葡萄糖C6H12O6、乳糖C12H22O11、麥芽糖C12H22O11·H2O 、鼠李糖C6H12O5、木糖C5H10O5、蔗糖C12H22O11、甘露醇C6H14O6、果糖C6H12O5、山梨糖醇C6H14O6和衛(wèi)矛醇C6H14O6發(fā)酵試驗(yàn)）、尿素酶試驗(yàn)、櫞酸鹽利用試驗(yàn)、甲基紅（MR）試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)對純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定和篩選，并記錄相應(yīng)的結(jié)果。

1.2.4 血清型鑒定

通過分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)后初步確診的大腸埃希菌接種在普通營養(yǎng)瓊脂斜面進(jìn)行純培養(yǎng)， 培養(yǎng)后用5g/L 的石炭酸生理鹽水將菌苔洗下，制成菌懸液，菌懸液在121℃的環(huán)境高壓處理2h，意在破壞大腸埃希菌的“K”抗原，待菌液冷卻后，挑取一鉑耳環(huán)菌液與已稀釋5 倍的大腸埃希菌O 抗原單價(jià)血清在玻板上混勻，同時(shí)菌懸液與生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象，若30s 內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性［5］。

1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

將鑒定為大腸桿菌的細(xì)菌菌液用滅菌生理鹽水稀釋至2×106CFU/mL 后接種到營養(yǎng)液中培養(yǎng)24～48h，以供攻毒用。 試驗(yàn)組選擇48 只清潔級BALB/c 小鼠每只分別腹腔內(nèi)注射0.2mL 菌液；對照組選擇5 只清潔級BALB/c 小鼠，每只分別在腹腔內(nèi)注射0.2mL 的生理鹽水，試驗(yàn)組和對照組接種后，觀察72h，隨時(shí)記錄小鼠的變化情況。 小鼠死亡后立即對胸腹腔內(nèi)實(shí)質(zhì)性器官進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查。

2 結(jié)果及分析

2.1 分離菌在鑒別培養(yǎng)基上的菌落特性

將收集到的病原菌接種到麥康凱瓊脂平板上，99 份供試樣品中有60 份在麥康凱瓊脂平板上出現(xiàn)圓形、中等大小的紅色菌落，表明這些菌落發(fā)酵乳糖，初步認(rèn)定為疑似大腸埃希菌菌落。其余39 份顯示為其他菌落或不存在典型菌落形成。

2.2 分離菌的染色鏡檢

取麥康凱培養(yǎng)基上紅色菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察到革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（圖1）。疑似60 株菌均為大腸埃希菌。

圖1 分離菌的染色鏡檢（革蘭氏染色）

2.3 生化實(shí)驗(yàn)

對60 株疑似大腸桿菌純培養(yǎng)后進(jìn)行生化試驗(yàn)， 結(jié)果表明（表1），5 株菌株不符合大腸桿菌生化特性，其余的55 株分離菌生化試驗(yàn)的特點(diǎn)明顯：能分解葡萄糖C6H12O6、乳糖C12H22O11、麥芽糖C12H22O11·H2O、鼠李糖C6H12O5、木糖C5H10O5、蔗糖C12H22O11、甘 露 醇C6H14O6、 果 糖C6H12O5、 山 梨 糖 醇C6H14O6和 衛(wèi) 矛 醇C6H14O6，尿素酶試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽利用率試驗(yàn)陰性，MR 試驗(yàn)陽性，V-P 試驗(yàn)陰性，吲哚試驗(yàn)陽性。 初步得出分離的60 株細(xì)菌有55 株為大腸桿菌。

2.4 血清型鑒定

對55 株大腸埃希菌采用O 抗原單價(jià)血清進(jìn)行血清型鑒定。結(jié)果表明（表2），48 株大腸埃希菌血清型實(shí)驗(yàn)陽性，分布在7個(gè)血清型中，其中優(yōu)勢血清型為O8（21 株），其他血清型包括O20（3 株），O45（3 株），O60（5 株），O139（5 株），O141（3 株），O149（8 株）。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

表2 大腸埃希菌血清型鑒定結(jié)果

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

對實(shí)驗(yàn)小鼠的發(fā)病情況和臨床癥狀進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)得出48 株分離細(xì)菌可引起小鼠出現(xiàn)活動性降低、采食量減少、全身間歇性顫抖等癥狀。 在攻毒48h 內(nèi)有24 株分離菌使小鼠死亡，發(fā)現(xiàn)血清型為O8的有18 株，O141的有3 株，O149的有3 株。 對死亡的小鼠進(jìn)行解剖， 分別取其心臟血在麥康凱瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h，均得到了疑似大腸埃希菌，挑取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察到革蘭氏陰性的、兩端鈍圓的短小桿菌。而對照組的5 只小鼠全部健康。分離株對小鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果見表3。

3 討論

表3 各血清型大腸埃希菌致病性試驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的方法是用腹瀉仔豬的肛門棉拭子進(jìn)行取樣， 對大腸桿菌進(jìn)行分離和鑒定，為防止因細(xì)菌含量低而造成檢測困難，實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行營養(yǎng)肉湯的前增菌，再進(jìn)行分離劃線，這樣保證接種平板時(shí)獲得較好地分離效果。 生化反應(yīng)是鑒定大腸桿菌的經(jīng)典方法，99 份樣品中有48 分鑒定為大腸桿菌， 進(jìn)一步通過血清學(xué)鑒定血型后， 培養(yǎng)菌懸液接種小鼠， 試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)活動性降低、采食量減少、全身間歇性顫抖等臨床癥狀，在攻毒48h 內(nèi)有24 株分離菌使小鼠死亡，對照組小鼠運(yùn)動和飲食均正常，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，在麥康凱培養(yǎng)基上，分離于豬和小鼠的菌株均呈玫紅色圓形菌落； 革蘭氏染色后菌體形態(tài)為兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。 綜合上述結(jié)果，最終確定松山區(qū)仔豬腹瀉大部分是由致病性大腸埃希菌所致，分離的48 株大腸桿菌菌株其中O8血清型有21 株，為優(yōu)勢血清型，O20血清型有3 株，O45血清型有3 株，O60血清型有5 株，O139血清型有5 株，O141血清型有3 株，O149血清型有8 株。 初步確定了赤峰地區(qū)豬場中大腸埃希菌的主要菌株的血清型，O8血清型是引起本地區(qū)仔豬腹瀉的最主要血清型菌株，O149次之， 這對本地區(qū)仔豬大腸桿菌病的防治具有重要意義。