QF-PCR技術(shù)檢測4262例胎兒常見染色體非整倍體結(jié)果回顧分析

周偉寧 杜倩怡 鐘志成 何天文 張艷霞 唐純芳

(1.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院新生兒外科，廣東 廣州 511442)

染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷最常見的遺傳病之一，新生兒各種染色體異常的發(fā)生率約為1/160，主要包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常，其中數(shù)目異常更為常見[1]。常見的5條染色體數(shù)目異常包括21、18、13、X、Y，引起了80%～90%以上的有臨床重大意義的染色體疾病[2,3]。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展，社會的科普及孕婦對其認識度的提高，診斷染色體數(shù)目異常的技術(shù)已在臨床上得到普遍的應(yīng)用，傳統(tǒng)的染色體核型技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用了很多年了，其金標準的地位至今沒被取代，但其報告周期長，實驗受環(huán)境影響大，有一定的失敗率，孕婦及家屬心情非常焦慮，不利于孕期健康，甚至可能引起醫(yī)患矛盾[4]。因此，一項快速穩(wěn)定的檢測技術(shù)對染色體非整倍體的產(chǎn)前診斷非常具有臨床價值。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)技術(shù)利用熒光引物對染色體上特異的多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)位點進行擴增，通過毛細管電泳，用熒光變量雙峰的比值對染色體數(shù)目進行判斷，這種技術(shù)方法具備快速、方便、成本低、通量高等優(yōu)點，而且還能進行污染鑒定，在國內(nèi)外一些大型的產(chǎn)前診斷機構(gòu)得到了廣泛的應(yīng)用[5-7]，這一技術(shù)在報告周期上比核型分析具有較大的優(yōu)勢[8]。很多孕婦對篩查高風(fēng)險非常的恐懼，QF-PCR能在48小時內(nèi)出結(jié)果，結(jié)果陰性就基本排除了80%以上的染色體疾病，可以減輕孕婦的心理負擔(dān)，對孕期檢查有很大的指導(dǎo)作用。我們實驗室的QF-PCR選擇雜合度高的STR位點比一般實驗室多，共24個，那準確率有多高呢？會不會出現(xiàn)假陽性或假陰性？本研究收集了產(chǎn)前診斷的病例標本4262例，將病例標本用QF-PCR和染色體核型分析兩種方法檢測后的結(jié)果進行比較，評估QF-PCR技術(shù)在大數(shù)據(jù)支持下的靈敏度和特異度，深入探討QF-PCR在染色體非整倍體產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的能力。另外，需要進行QF-PCR檢測的原因有好幾種，我們統(tǒng)計染色體非整倍體在不同的產(chǎn)前診斷指征中的陽性率，了解數(shù)據(jù)對臨床咨詢的參考意義。

1 資料與方法

1.1 基本資料 收集2018年1月1日至2018年12月30日在廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心門診進行產(chǎn)前診斷的高風(fēng)險孕婦的標本，并用QF-PCR共成功檢測4262例，染色體核型分析成功檢測4254例，8例培養(yǎng)失敗。高風(fēng)險的指標包括孕婦年齡≥35歲、唐氏綜合征血清學(xué)篩查高風(fēng)險、無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查高風(fēng)險、超聲軟指標異常、染色體異常兒生育史等。

1.2 方法 所有進行產(chǎn)前診斷的孕婦都簽署知情同意書，絨毛穿刺在11～14周，羊水穿刺在16～24周，臍血穿刺在24周之后。絨毛標本210例，羊水標本3940例，臍血標本112例。羊水標本采集20ml，其中15ml用于核型分析，5ml用于QF-PCR；臍血標本2ml，1.5 ml用于核型分析，0.5 ml用于QF-PCR。

1.2.1 染色體核型分析 核型分析首先按照常規(guī)細胞培養(yǎng)，制片G顯帶，參照 ISCN(2009)標準進行核型分析。

1.2.2 QF-PCR

1.2.2.1 DNA提取預(yù)處理 ①絨毛：在顯微鏡下挑取絨毛2根，用生理鹽水清洗后加入蛋白酶K和ATL組織裂解液200μl，56℃水浴5～10分鐘直到組織溶解；②羊水：2200rpm/min離心10min，去上清留細胞液200μl；③臍血：混勻后取200μl。

1.2.2.2 采用QIAGEN試劑盒對預(yù)處理的標本按照說明書提取步驟進行處理。

1.2.2.3 引物合成 引物設(shè)計從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取5條染色體中24個多態(tài)位點作為引物序列。13號染色體位點4個：D13S305、D13S628、D13S634 和 D13S742；18號染色體位點5個：D18S978、D18S386、D18S391、D18S535 和 D18S1002；21號染色體位點7個：D21S1411、D21S1412、D21S1414、D21S11、D21S2039、D21S1435、D21S1437，性染色體的STR位點8個：AMEL、SRY、DXS7423、X22、DXS1187、DXS981、DXYS218、DYS448。檢測位點的引物上游5’端采用不同熒光標記，引物的合成和標記由TAKARA公司完成。

1.2.2.4 擴增 ①TAKARA公司的PCR反應(yīng)混合液25μl，引物7.5μl，DNA模板5μl，總體積25ul。使用ABI9700PCR儀器進行擴增。②反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，94℃變性 30s，最適退火溫度保溫30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸60min，置4℃保存。

1.2.2.5 毛細管電泳檢測 ①取9μl的上樣液(甲酰胺8.6μl加分子內(nèi)標internal lane standard 600 0.4ul)和1μl PCR產(chǎn)物混合；②PCR儀器95℃變性5min后放冰上5min；③ABI 3500測序儀采用POP-4凝膠進行毛細管電泳。

1.2.2.6 結(jié)果分析 ①將電泳數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入軟件Gene Scan3.7進行分析。②根據(jù)國際公認的判斷標準(ACC/CMGS)對結(jié)果進行判斷。正常：STR位點兩個等位基因熒光信號峰面積比例在0.8～1.4之間。三體：STR位點等位基因擴增產(chǎn)物電泳后呈現(xiàn)3個熒光峰，峰面積的比例約為1∶1∶1；呈現(xiàn)的是雙峰，比例>1.8或<0.65。如果STR位點的等位基因呈現(xiàn)的是單峰，認為是無效峰，每一條染色體必須要有兩個以上STR位點異常才能判斷為異常。

2 結(jié)果

2.1 QF-PCR檢測結(jié)果 成功檢測總例數(shù)4262例，正常3957例，占總例數(shù)92.8%，陽性數(shù)是305例，陽性率為7.2%，其中21-三體184例，占總陽性例數(shù)的60.3%，18-三體62例(20.3%)，13-三體24例(7.9%)，X單體12例(3.9%),XXY10例(3.3%)，XYY6例(2.0%)，XXYY2例(0.7%)，21-三體嵌合體3例(1.0%)，X/XX嵌合體2例(0.7%)。

2.2 染色體核型分析結(jié)果 送檢標本4262例，成功檢測4254例，其中有8例培養(yǎng)失敗，成功率99.8%。在成功檢測的4254例標本中，結(jié)果正常有3900例，占91.7%。陽性標本354(8.3%)，其中包括非整倍體300例(21-三體184例，18-三體62例，13-三體24例，X單體12例，XXY 10例，XYY 6例，XXYY2例)，46例結(jié)構(gòu)異常和8例嵌合體。

2.3 兩種方法驗證對比 4262例QF-PCR檢測標本用染色體核型分析金標準進行驗證，其中8例培養(yǎng)失敗，這8例標本用QF-PCR檢測為陰性。將兩種方法都成功地對4254例標本進行比較，304例非整倍體符合。結(jié)構(gòu)異常共46例，不在QF-PCR 的檢測范圍內(nèi)。核型分析檢測出的8例嵌合體中，QF-PCR只檢測出4例，漏診率達50%。有1例嵌合體QF-PCR檢測陽性，而核型分析是陰性(表1)。以染色體核型分析作為檢測金標準，QF-PCR技術(shù)的靈敏度為85.9%，特異度為99.9%(表2)。把結(jié)構(gòu)異常等不在檢測范圍內(nèi)的標本剔除后的靈敏度和特異度分別為98.7%和99.9%(表3)。

2.4 不同產(chǎn)前診斷指征的染色體非整倍體的陽性率 根據(jù)這些孕婦的就診病歷，按最主要的產(chǎn)前診斷指征，我們大概分為以下常見幾類，①唐氏綜合征篩查高風(fēng)險；②無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查高風(fēng)險；③胎兒超聲異常包括發(fā)育遲緩、腦室增寬、唇腭裂、羊水過多、羊水過少、心臟異常，臍血流異常等；④頸項透明層厚度(nuchal translucecy， NT)增厚； ⑤不良孕產(chǎn)史包括生育過唐氏患兒，胎死宮內(nèi)等；⑥孕婦年齡≥35歲等等，筆者嘗試對這些常見的高風(fēng)險指標最終診斷為染色體非整倍體的陽性率進行分類統(tǒng)計，詳細見表4。

表1 4262例樣本產(chǎn)前診斷結(jié)果對比

表2 統(tǒng)計QF-PCR的靈敏度和特異度(例)

注：靈敏度=304/(304+50)×100%=85.9% ，特異度=3899/(1+3899)×100%=99.9%；+表示檢測結(jié)果陽性；-表示檢測結(jié)果陰性。

表3 統(tǒng)計QF-PCR的靈敏度和特異度(例)

注：靈敏度=304/(304+4)×100%=98.7% ；特異度=3899/(1+3899)×100%=99.9%；+表示檢測結(jié)果陽性；-表示檢測結(jié)果陰性。

表4 不同產(chǎn)前診斷指征的染色體非整倍體的陽性率(例)

3 討論

大家都清楚染色體非整倍體疾病是一種危害非常嚴重的常見遺傳病，其主要臨床表現(xiàn)是發(fā)育遲緩，智力低下，多發(fā)畸形，甚至致死致殘，給家庭帶來沉重的精神壓力和經(jīng)濟負擔(dān)[9]。到目前為止預(yù)防染色體非整倍體患兒的出生目前主要還是對孕婦進行唐氏綜合征血清學(xué)的篩查，高風(fēng)險再進行無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查或產(chǎn)前診斷。染色體核型分析準確率高，金標準的地位依然未能動搖，但報告周期太長，孕婦及家屬都會非常擔(dān)心，而且標本需要培養(yǎng)，容易受環(huán)境影響，有一定的失敗率，容易引起醫(yī)患矛盾，這些都是染色體核型分析不可避免的缺點[10]。QF-PCR技術(shù)對標本要求較低，量要求較少，不需要培養(yǎng)，只要對標本提取DNA即可，失敗率低，48小時內(nèi)就能出報告，其非常重要一點是能夠?qū)Ξa(chǎn)前診斷標本進行母血污染鑒定，這是很多方法不可比擬的優(yōu)點[11]。QF-PCR同時也存在缺點，不能取代染色體核型分析單獨進行產(chǎn)前診斷，如只能檢測常見的5條染色體數(shù)目異常，不能檢測結(jié)構(gòu)異常，嵌合體和少數(shù)性染色體異常診斷會比較困難[12-13]，QF-PCR在產(chǎn)前診斷方面的診斷價值早期就有些文獻報道，但數(shù)據(jù)都不是很大，QF-PCR靈敏度和特異度沒有大數(shù)據(jù)的支持，對于一些嵌合體的檢出率就更少了，而我們采用的STR位點非常多，雜合度高，在診斷方面更加的容易[14]。

本研究收集了1年的標本病例，回顧性分析了4262例QF-PCR產(chǎn)前診斷的標本，并每一例標本都和染色體核型結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)：①核型分析有8例標本培養(yǎng)失敗，這8例標本QF-PCR都檢測出來了，結(jié)果是陰性的，QF-PCR技術(shù)和染色體核型分析技術(shù)在常見5條染色體(13、18、21、X、Y)非整倍體的診斷符合率達98.8%。②核型分析發(fā)現(xiàn)8例嵌合體而QF-PCR只檢測出4例，對于高比例的嵌合如30%以上，QF-PCR能起到提示作用，對于低比例的嵌合，QF-PCR技術(shù)也無能為力，這些觀點某些文獻已有報道[15]。而值得一提的是其中有1例標本QF-PCR提示是21-三體嵌合體，而染色體核型分析并沒有發(fā)現(xiàn)異常，最后用FISH技術(shù)也檢測出約35%比例的嵌合，對于比例并不低的三體嵌合核型分析未檢出的原因科室也做了討論，考慮羊水細胞在培養(yǎng)過程中，異常細胞被淘汰的可能，因此，染色體核型分析和QF-PCR結(jié)果不符合，需要第三技術(shù)進行驗證，不能完全依靠核型分析做診斷。③參照染色體核型分析作為金標準，QF-PCR檢測技術(shù)的靈敏度和特異度的是85.9%和99.9%，如果剔除結(jié)構(gòu)異常等不在QF-PCR檢測范圍內(nèi)的標本，在常見5條染色體(13、18、21、X、Y)非整倍體的檢測范圍內(nèi)靈敏度和特異度分別為98.7%和 99.9%。

孕婦年齡≥35歲(高齡)、胎兒頸項透明層增厚、唐氏綜合征血清學(xué)篩查高風(fēng)險，這些都是發(fā)生染色體非整倍體的高風(fēng)險指標，也是比較常見的產(chǎn)前診斷指征，除此之外，胎兒超聲異常、不良孕產(chǎn)史等臨床上都會建議行QF-PCR，核型分析，全基因組芯片分析等方法進行產(chǎn)前診斷，不同的指征最后診斷為(13、18、21、X、Y)非整倍體的陽性率究竟有多高，甚少文獻報道，這對于臨床醫(yī)生的遺傳咨詢也有一定的指導(dǎo)價值，經(jīng)過分類匯總發(fā)現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查高風(fēng)險陽性率最高，達到77.6%，其次是胎兒頸項透明層增厚、胎兒超聲異常、唐氏篩查高風(fēng)險，陽性率在8%～10%，高齡陽性率4.4%。高危妊娠、不良孕產(chǎn)史陽性率較低，分別為3.9%和1.0%，雙親染色體異常、IVF陽性率為零，這樣分類的科學(xué)性和嚴謹性暫時沒有找到文獻的支持，但結(jié)果和我們的共識也很接近。

綜上所述，QF-PCR技術(shù)在48小時內(nèi)能成功地對常見5條染色體(13、18、21、X、Y)非整倍體進行快速診斷，靈敏度，特異度和成功率高，在低比例的嵌合體非常容易漏診，但它也能發(fā)現(xiàn)核型分析因培養(yǎng)因素漏診的嵌合體，因此，染色體核型分析和QF-PCR結(jié)果不符合，需要第三技術(shù)進行驗證，不能完全依靠核型分析作診斷。另外關(guān)于不同產(chǎn)前診斷指征最終診斷為常見5種染色體非整倍體的陽性率，對臨床醫(yī)生遺傳咨詢有一定的參考價值。