奇臺窖藏馬鈴薯病害病原鑒定

呂 卓，高勇剛，唐琦勇，楚 敏，顧美英，朱 靜，程思琦，馬曉雪，宋素琴，王 靜

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室,烏魯木齊 830091；3.五家渠新薯種業(yè)有限公司,新疆五家渠 831300)

0 引 言

【研究意義】新疆馬鈴薯主要種植在北疆地區(qū)，種植面積一般穩(wěn)定在36.7 ×103hm2左右 (包括新疆兵團約6.1 ×103hm2[1]。奇臺地處昌吉州東部，南依天山，屬中溫帶大陸性半荒漠干旱性氣候，是北疆馬鈴薯主要種植區(qū)之一。2018年奇臺的馬鈴薯種植面積為0.13×104hm2[2]，占昌吉州馬鈴薯面積的20%，占新疆馬鈴薯面積的5%[3]。近年來，隨著新疆馬鈴薯種植面積逐漸擴大，馬鈴薯病害的發(fā)生與危害日趨嚴重，降低了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。新疆馬鈴薯80%以農(nóng)戶窖藏為主，窖藏病害損失達20%～30%[3]。【前人研究進展】已報道新疆馬鈴薯窖藏病害有：干腐病 (Fusariumsp.)、黑痣病(Rhizoctoniasolani)、晚疫病(Phytophthorainfestans)、黃萎病(Verticilliumdahliae)、早疫病(Alternariasolani)和皮斑病(Polyscytalumpustulans)[4]?！颈狙芯壳腥朦c】奇臺是新疆馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)之一，也是馬鈴薯的種植老區(qū)，該區(qū)域馬鈴薯窖藏病害發(fā)生較為嚴重，在新疆具有代表性和典型性，研究引起新疆奇臺窖藏馬鈴薯發(fā)生病害的病原菌種類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采樣馬鈴薯窖藏病薯，對病原菌進行分離鑒定和致病性測定，研究引起該地區(qū)馬鈴薯窖藏病害的病原菌種類，為新疆馬鈴薯的窖藏病害科學防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

2019年3月從新疆奇臺農(nóng)場3個大窖中采集病薯(大西洋品種)，隨機取30個病薯塊莖，觀察外表并選擇6個典型病癥的薯塊進行研究。

致病力測定：大西洋塊莖購買于新疆烏魯木齊市北園春農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 試劑與儀器

培養(yǎng)皿(90 mm)、試管(10 mm×100 mm)、小刀、酒精燈、滅菌竹簽，均購自新疆鼎國昌盛有限公司。

HVE-50自動高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250BF生化培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；SC-316 4℃立式保藏柜，海爾HAIER公司；NEP025-1回收試劑盒，鼎國昌盛有限公司；DL9700 PCR儀，東林昌盛有限公司；CH20BIMF200光學顯微鏡，日本Olympus有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離與純化

將病薯塊莖的病健交界處削出5 mm的皮和塊莖組織，用75%的乙醇表面消毒3 min，再用無菌水沖洗3次，用滅菌干燥的濾紙吸去表面水分后放置于無菌的PDA平板上置30℃條件下培養(yǎng)3～4 d后，再用滅菌竹簽挑取病組織周圍長出的菌落，在PDA平板上劃線純化，于30℃下培養(yǎng)，重復(fù)上述操作直至獲得純菌落，再轉(zhuǎn)接于PDA斜面30℃培養(yǎng)3～4 d，置4℃冷藏下保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則采用傷口接種測定致病性并進行致病力比較[4]。通過比較發(fā)病程度來確定各致病菌的致病強弱。

1.2.3 菌株的形態(tài)及結(jié)構(gòu)觀察

挑取已純化好的病原菌單菌落，將其接至PDA培養(yǎng)基中心位置，封口，于30℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落的形態(tài)，顯微觀察菌絲及菌體形態(tài)[6,7]。

1.2.4 菌株的分子鑒定

細菌的分子鑒定通過測定16S rDNA序列，擴增引物為F16S-27(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和R16S-1492(CGGTTACCTTGTTACGACTTC)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送鼎國昌盛有限公司進行測序。將已測序的序列在NCBI上進行Blast比對，選取同源性較高和形態(tài)相近菌株序列。表1

真菌的分子鑒定通過測定ITS序列，引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送鼎國昌盛有限公司進行測序。將已測序的序列在UNITE、NCBI上進行Blast比對，選取同源性較高和形態(tài)相近菌株序列。表2

表1 細菌PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system of bacterial

表2 真菌PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system of fungi

注：a：可培養(yǎng)細菌電泳； b：可培養(yǎng)真菌電泳
Note:a：Cultivable bacterial electropherogram；b：Culturable fungus electrophoresis map

圖1 分離菌株P(guān)CR擴增電泳
Fig.1 PCR amplified electrophoresis map of the isolations

2 結(jié)果與分析

2.1 窖藏病害病原鑒定及分子輔助鑒定

研究表明,從奇臺窖藏感病馬鈴薯上分離到12株菌株，其中細菌5株，真菌7株，12株菌的PCR擴增電泳圖，將測序序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對并用MEGA V7.0做系統(tǒng)發(fā)育樹，這些菌株分別屬于芽孢稈菌屬(Bacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鐮孢(霉)屬(Fusarium)、帚霉屬(Pseudoscopulariopsis)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、赤霉菌屬(Gibberella)、地霉屬(Geotrichum)、曲霉屬(Aspergillus)9個不同屬。表3,表4,圖1～3

表3 奇臺窖藏病薯中可培養(yǎng)細菌的種類Table 3 Isolation of culturable bacteria from potato in Qitai cellar

表4 奇臺窖藏病薯中可培養(yǎng)真菌的種類Table 4 Isolation of pathogenic fungi from potato diseases in Qitai cellar

注：“-”表示未發(fā)現(xiàn)病害癥狀
Note：“-”Indicates that no symptoms of the disease were found

圖2 奇臺窖藏病薯中可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.2 Phylogenetic tree of cultured bacteria isolated from diseased potato from the Qitai cellar

圖3 奇臺窖藏病薯中可培養(yǎng)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 Phylogenetic tree of cultured fungi isolated from diseased potato from the Qitai cellar

2.2 致病性測定結(jié)果及病原菌培養(yǎng)形態(tài)

研究表明,20 d后的部分接菌薯塊的表面已出現(xiàn)腐爛癥狀，有的接菌薯塊腐爛癥狀存在于馬鈴薯內(nèi)部。致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)、白地霉(Geotrichumcandidum)對馬鈴薯存在致病性。在接種相同時間比較發(fā)病程度，傷口接虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)的第4 d，薯塊傷口處出現(xiàn)環(huán)形腐壞癥狀；傷口接致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的第20 d，馬鈴薯腐爛嚴重；傷口接白地霉(Geotrichumcandidum)的第20 d，薯塊切開后發(fā)現(xiàn)輕微腐爛，故確定致病性強度排序為虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)>尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)>白地霉(Geotrichumcandidum)。圖4 ～6

Note:a、e、l：CK；b、c：Gibberellapulicaris；d：Pseudoscopulariopsishibernica；f、g、h：Fusariumoxysporum；i：Geotrichumcandidum；j：Talaromycesassiutensis；k：Aspergillusversicolor

圖4 真菌分離物的致病性測定
Fig.4 Pathogenicity test of fungal isolations

2.2.1 鐮刀菌Fusarium

致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，病菌形態(tài)顯示，菌落為粉色，形態(tài)呈鐮刀狀，且周圍附著著分生孢子。通過菌餅將病原菌接種在馬鈴薯塊莖上后發(fā)現(xiàn)：病斑部分按壓稍軟，且有明顯的腐臭味；內(nèi)部出現(xiàn)黃褐色、不定形病斑，且侵染面積較廣，擠壓有菌膿；再次挑取病菌與原接種菌比較，確定為相同菌株。圖5

2.2.2 赤霉菌Gibberella

虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)菌落呈黃色粉狀，顯微形態(tài)下菌絲周圍多附著鐮刀狀的孢子。在傷口接菌的第4 d，薯塊傷口處出現(xiàn)環(huán)形腐壞癥狀；20 d后隨著病斑逐漸擴大，表皮下陷并皺縮，把病薯切開后，內(nèi)部有空洞呈壞死狀變褐，伴有菌絲生長，到后期發(fā)病嚴重時，塊莖整個皺縮腐爛，表皮上長出霉狀物。再次挑取病菌與原接種菌比較，確定為相同菌株。圖6

注：a：傷口接菌圖；b：病菌菌落圖；c：病菌形態(tài)圖(顯微鏡40×)
Note:a：Wound colonization map；b：Pathogen colony diagram；c：Pathogen morphology map(microscope 40×)

圖5 致病性尖孢鐮刀菌
Fig.5Fusariumoxysporum

注：a：傷口接菌圖；b：病菌菌落圖；c：病菌顯微形態(tài)圖(顯微鏡100×)
Note:a：Wound colonization map；b：Pathogen colony diagram；c：Pathogen morphology map(microscope 100×)

圖6 虱狀赤霉
Fig.6Gibberellapulicaris

2.2.3 白地霉菌Geotrichum

白地霉(Geotrichumcandidum)病菌形態(tài)顯示，菌落扁平呈圓形，乳白色，表面短絨狀且近于粉狀，背面基質(zhì)無色，呈放射線狀生長，邊緣色淺，清晰。菌絲呈二叉分枝，有橫隔，無色。塊莖發(fā)病癥狀：外觀病斑呈圓形趨勢，病斑下薯肉組織呈不定形向下擴展且易剝離，內(nèi)部果肉縮小發(fā)灰，后期出現(xiàn)大量白色霉層；再次挑取病菌與接種菌比較，確定為相同菌株。圖7

注：a：傷口接菌圖；b：病菌菌落圖；c：病菌形態(tài)圖(顯微鏡40×)
Note:a：Wound colonization map；b：Pathogen colony diagram；c：Pathogen morphology map(microscope 40×)

圖7 白地霉
Fig.7Geotrichumcandidum

3 討 論

馬鈴薯干腐病是鐮刀菌根腐類病害中最重要的一種病害，其窖藏期發(fā)病率最高可達60%，馬鈴薯干腐病的病原菌多為接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)、銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和芳香鐮刀菌(Fusariumredolens)等[8]；據(jù)Rakhimov等[9]報道，枯萎病由鐮刀菌的5個不同種引起的，即腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、雪腐鐮刀菌(Fusariumnivale)、接骨木鐮刀菌(Fusariumsambucinum)。楊波等[10]明確了引起青海省馬鈴薯根腐類病害鐮刀菌次為三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)和木賊鐮刀菌(F.equiseti)。陳祥泰[11]明確了甘肅省窖藏真菌病害主要有12種病菌引起的6種病害，分別是干腐病、黑痣病、炭疽病、壞疽病、束梗褐腐病和晚疫病，干腐病病原共分離到7種；岷縣馬鈴薯窖藏干腐病茄腐鐮孢和木賊鐮孢菌為主要病原。虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)是鐮刀菌(Fusariumsambucinum)的有性階段，是北美和歐洲馬鈴薯塊莖干腐病的主要病原[12]。在新疆奇臺窖藏馬鈴薯病薯中分離出致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)真菌病原菌，分離到的細菌都不是馬鈴薯細菌病害的致病菌。

白地霉(Geotrichumcandidum)可引起巴西紅果[6]、甘薯[13]、番茄等多種植物的酸腐病。研究首先在新疆尼勒克生長期馬鈴薯分離得到，之后又在新疆奇臺窖藏感病馬鈴薯塊莖中分離出該菌。

4 結(jié) 論

從奇臺窖藏馬鈴薯中分離得到12株菌株。其中，細菌5株，分別屬于芽孢稈菌屬(Bacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、單胞菌屬(Stenotrophomonas)，都不是馬鈴薯細菌病害的致病菌；其余7株為真菌，分別屬于鐮孢(霉)屬(Fusarium)、帚霉屬(Pseudoscopulariopsis)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、赤霉菌屬(Gibberella)、地霉屬(Geotrichum)、曲霉屬(Aspergillus)等。致病性測定結(jié)果表明病原菌有致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、虱狀赤霉(Gibberellapulicaris)、白地霉(Geotrichumcandidum)。其中白地霉(Geotrichumcandidum)在馬鈴薯上引起病害為國內(nèi)首次報道。