不同動(dòng)物糞源葡萄球菌耐藥性調(diào)查及耐藥基因檢測分析

楊紫嫣，姚曉慧，馬木爾·阿克木漢，王舒豐，王 凱，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】葡萄球菌(Staphylococcus)是革蘭氏陽性菌，形態(tài)呈球形或稍橢圓形，因成葡萄串狀，故名。其無鞭毛，無芽胞，多數(shù)為非致病菌，少數(shù)可致病。含有50多個(gè)種及亞種，在自然界中分布廣泛，同時(shí)存在于人和動(dòng)物的皮膚表面以及其鼻、咽和腸道中。葡萄球菌屬于條件性致病菌，是最常見的化膿性球菌，可引起動(dòng)物的乳房炎，關(guān)節(jié)炎以及葡萄球菌敗血癥等疾病[1]，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失。【前人研究進(jìn)展】已有報(bào)道表明，在養(yǎng)殖場周圍的環(huán)境和空氣中含有許多不同種的葡萄球菌，如：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和科氏葡萄球菌等，其中金黃色葡萄球菌致病力最強(qiáng)且含量最多，占葡萄球菌屬的24%左右，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌含量次之，且致病力也較低[1]。葡萄球菌可引起多種感染，但引起的呼吸系統(tǒng)疾病占首位(65%)，葡萄球菌是上呼吸道感染的主要病原菌[2]，在動(dòng)物臨床上，可引起患病動(dòng)物滲出性皮炎，導(dǎo)致動(dòng)物生長發(fā)育緩慢，嚴(yán)重的葡萄球菌感染可引起仔畜死亡，并在畜群中廣泛傳播，引起巨大危害及經(jīng)濟(jì)損失[3]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為了提高治療效果或達(dá)到預(yù)防疾病發(fā)生的效果，抗菌藥物廣泛且大量的用于臨床，造成耐藥菌株的數(shù)量急速上升[4]，導(dǎo)致通常有效的抗菌藥物失去作用，給臨床治療帶來極大的困難[5]。耐藥葡萄球菌在影響家畜健康的同時(shí)也造成環(huán)境的污染，也可通過食物鏈將耐藥性傳播給人類，對(duì)人類的健康構(gòu)成威脅[6]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】新疆霍城縣作為新疆伊犁地區(qū)重要的畜牧養(yǎng)殖基地，然而有關(guān)霍城縣不同動(dòng)物源葡萄球菌耐藥情況未見報(bào)道，耐藥現(xiàn)狀不明，在新疆霍城縣主要規(guī)?；B(yǎng)殖場，對(duì)不同動(dòng)物糞源葡萄球菌進(jìn)行臨床常用抗菌藥物的耐藥調(diào)查及相關(guān)耐藥基因檢測，獲取的相應(yīng)數(shù)據(jù)，指導(dǎo)臨床合理用藥，為新疆霍城地區(qū)葡萄球菌耐藥數(shù)據(jù)庫的建設(shè)提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年10月在新疆霍城縣不同規(guī)?；B(yǎng)殖場進(jìn)行樣品采集。采集豬糞源(長白)100份、羊糞源(阿勒泰)200份、牛糞源(褐牛)198份以及禽糞源(黑羽)300份，共計(jì)798份。以金黃色葡萄球菌ATCC29213作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌(杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄球菌分離鑒定

從采集的樣品中吸取10 μL置于滅菌的含7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯中，經(jīng)37℃恒溫?fù)u床增菌6～8 h后，用接種環(huán)蘸取一環(huán)增菌菌液在加有亞碲酸鹽卵黃增菌液的Baird-Parker瓊脂平板上劃線接種，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。葡萄球菌在Baird-Parker瓊脂平板上為灰黑色至黑色有光澤圓形菌落，表面光滑濕潤，挑取可疑單個(gè)菌落于1 mL營養(yǎng)肉湯中吹打混勻并增菌后保存?zhèn)溆谩?duì)疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色，選取鏡檢為紫色且呈葡萄串狀排列，無芽孢、無莢膜的菌株，保存?zhèn)溆?。同時(shí)進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，挑取已培養(yǎng)18～24 h菌落于玻片上，滴加3%過氧化氫，立即出現(xiàn)氣泡的菌株即為觸酶試驗(yàn)陽性。確定為葡萄球菌的菌株保菌于60%的甘油肉湯中，-20℃保存并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 抗菌藥物與培養(yǎng)基

試驗(yàn)共選用β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、氨基糖苷類、林可胺類、四環(huán)素類和福霉素類7大類10種抗菌藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

抗菌藥物：阿莫西林/克拉維酸(Amoxicillin/Clavulanic Acid，A/C)、頭孢噻呋(Ceftiofur，EFT)、苯唑西林(Benzene，OX)；氧氟沙星(Levo-floxacin，DF)；氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)FC)；阿米卡星(Amikacin，AMK)、慶大霉素(Gentamicin，GEN)；克林霉素(Clindamycin，CM)；四環(huán)素(Tetracycline，TE)和利福平(Rifampicin，RP)。(購自中國獸藥監(jiān)察所)。

培養(yǎng)基：MH肉湯(Mueller-Hinton Broth)，瓊脂粉培養(yǎng)基(均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；BP(Baird-Parker)瓊脂平板基礎(chǔ)，亞碲酸鹽卵黃增菌液(均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；氯化鈉(購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

試驗(yàn)采用歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(EUCAST)[7]推薦的瓊脂稀釋法操作程序，檢測葡萄球菌對(duì)上述10種抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)值，根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果的判定。(金黃色葡萄球菌ATCC29213為質(zhì)控菌株)。

1.2.4 耐藥基因檢測

DNA模板制備方法如下：對(duì)純化后的葡萄球菌重新在BP瓊脂平板上劃線接種，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后，刮取1～2接種環(huán)菌苔加入50 μL TE中，100℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清作模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)行5類7種耐藥基因的檢測，包括：β-內(nèi)酰胺類的mecA和femA耐藥基因、四環(huán)素類的tetA基因、喹諾酮類的norA基因、酰胺醇類的cfr和fexA基因，以及林可胺類的ermB基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，獲取的序列利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序進(jìn)行比對(duì)。耐藥基因的引物序列。表1

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄球菌分離鑒定

研究共采集不同動(dòng)物糞源共計(jì)樣品798份，共分離出葡萄球菌554株，葡萄球菌總體分離率為69.4%。其中，采集豬糞源樣品100份，分離葡萄球菌48株，分離率為48.0%；采集牛糞源樣品198份，分離葡萄球菌127株，分離率為64.1%；采集羊糞源樣品200份，分離葡萄球菌116株，分離率為58.0%；采集雞糞源樣品300份，分離葡萄球菌263株，分離率為87.7%。表2

2.2 不同動(dòng)物源葡萄球菌MIC

研究表明,豬糞源葡萄球菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、氟苯尼考、氧氟沙星、利福平、頭孢噻呋、克林霉素、四環(huán)素、苯唑西林10種抗菌藥物的耐藥率依次為3.0%、22.7%、30.3%、43.9%、59.1%、63.6%、66.7%、74.2%、83.3%、84.8%。其中氧氟沙星、利福平、頭孢噻呋、克林霉素、四環(huán)素、苯唑西林耐藥率均超過50%。

雞糞源葡萄球菌對(duì)阿米卡星、阿莫西林/克拉維酸、利福平、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、克林霉素、苯唑西林、四環(huán)素10種抗菌藥物的耐藥率依次為7.4%、17.8%、35.2%、40.3%、41.6%、44.0%、79.5%、88.9%、91.9%、93.0%。氟苯尼考、克林霉素、苯唑西林、四環(huán)素耐藥率均超過75%。圖1

圖1 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌的耐藥率
Fig.1 Resistance rate ofStaphylococcusin different animals

表1 被檢耐藥基因的擴(kuò)增引物序列及片段長度Table 1 Primer sequences and amplification fragment length of the resistant gene

表2 不同動(dòng)物糞源的葡萄球菌分離結(jié)果Table 2 Separation of Staphylococcus from different animals

羊糞源葡萄球菌對(duì)慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、氧氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、四環(huán)素、頭孢噻呋、利福平、克林霉素、苯唑西林10種抗菌藥物的耐藥率依次為4.2%、15.6%、19.3%、44.8%、45.3%、50.5%、53.1%、53.1%、67.7%、72.9%。

牛糞源葡萄球菌對(duì)氟苯尼考、阿莫西林/克拉維酸、四環(huán)素、克林霉素、氧氟沙星、利福平、頭孢噻呋、苯唑西林8種抗菌藥物的耐藥率依次為1.4%、2.9%、7.2%、11.6%、32.6%、33.3%、34.1%、59.4%。牛糞源葡萄球菌對(duì)阿米卡星和慶大霉素均100%敏感。牛糞源葡萄球菌整體耐藥情況比其他3種動(dòng)物糞源葡萄球菌耐藥情況較輕。圖1

2.3 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌多藥耐藥結(jié)果

研究表明,雞糞源葡萄球菌主要以4耐(24.8%)和5耐(25.2%)為主，占50%，且有9株菌對(duì)被檢的10種抗菌藥物全部耐藥；豬糞源葡萄球菌以5耐(13.6%)、7耐(16.7%)和8耐(18.2%)為主，占48.5%；羊糞源葡萄球菌主要以1耐(12.5%)、2耐(12.5%)、5耐(12.5%)和8耐(13.5%)為主，占51.0%；牛糞源葡萄球菌以0耐(23.2%)、1耐(26.8%)和3耐(22.5%)為主，占72.5%。圖2

圖2 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌的多藥耐藥率比較
Fig.2 Comparison of multidrug resistance rates of Staphylococcus from different animals

2.4 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌耐藥基因檢測結(jié)果

用PCR方法檢測5大類7種耐藥基因檢測結(jié)果顯示。豬糞源葡萄球菌和雞糞源葡萄球菌檢出率最高的是ermB，檢出率分別是70.8%和93.5%；羊糞源葡萄球菌和牛糞源葡萄球菌檢出率最高的是femA，檢出率分別是22.4%和17.3%。圖3

圖3 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌的耐藥基因檢測
Fig.3 Staphylococcus resistance gene detection in different animals

3 討 論

3.1 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌耐藥情況

研究結(jié)果顯示，豬源菌對(duì)四環(huán)素、氧氟沙星、頭孢噻呋、苯唑西林、利福平、克林霉素6種抗菌藥物耐藥率超過50%。雞源菌對(duì)四環(huán)素、苯唑西林、氟苯尼考、克林霉素4種抗菌藥物的耐藥率超過50%，且雞源菌對(duì)四環(huán)素和苯唑西林的耐藥率超過90%。羊源菌對(duì)四環(huán)素、頭孢噻呋、苯唑西林、利福平、克林霉素5種抗菌藥物耐藥率超過50%。而牛源菌僅對(duì)苯唑西林一種抗菌藥物的耐藥率超過50%。耐藥程度由高到低依次為豬糞源葡萄球菌>雞糞源葡萄球菌>羊糞源葡萄球菌>牛糞源葡萄球菌。豬糞源葡萄球菌對(duì)被檢抗菌藥物耐藥最嚴(yán)重，結(jié)合采樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)今豬場集約化養(yǎng)殖是現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展的方向，但是很多養(yǎng)殖戶其設(shè)施設(shè)備還未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化的要求，為追求利潤的最大化，往往會(huì)選擇超規(guī)模養(yǎng)殖，導(dǎo)致生豬生存環(huán)境差，易發(fā)病。生豬發(fā)病后，養(yǎng)殖戶為了不虧本，盲目選擇藥物、多藥物配伍、加大劑量給與治療，使發(fā)病的生豬在不規(guī)范用藥的環(huán)境中被動(dòng)攝入多類且量大的藥物，在無形之間導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增加。研究結(jié)果顯示，豬糞源葡萄球菌對(duì)過去治療葡萄球菌的β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和林可胺類均有較高的耐藥率，這可能與該類藥物被長期、大量不合理使用有關(guān)[2]。所以為了防止耐藥性的產(chǎn)生，臨床用藥時(shí)應(yīng)注意嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥，不濫用抗菌藥物，單一抗菌藥物有效的就不要采用聯(lián)合用藥，保證用藥劑量和用藥持續(xù)時(shí)間。其次規(guī)模化養(yǎng)殖的雞場環(huán)境普遍較差，雞群作為高密度集中飼養(yǎng)的食品動(dòng)物，養(yǎng)殖戶為確保雞群的健康，防止發(fā)病后出現(xiàn)大規(guī)模死亡等現(xiàn)象，在日常管理中不得不使用大量的抗生素，增加養(yǎng)殖成本，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)各種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，療效下降，陷入了“耐藥-換藥(加藥)-再耐藥”的迷途困境，治療之路越走越窄[11]。羊糞源葡萄球菌和牛糞源葡萄球菌耐藥情況相對(duì)不嚴(yán)重，原因可能是動(dòng)物處于半放牧的飼養(yǎng)方式，使用抗菌藥物時(shí)無法集中給藥，導(dǎo)致動(dòng)物攝入的抗菌藥物含量偏少。

3.2 不同動(dòng)物糞源葡萄球菌耐藥基因檢測

實(shí)驗(yàn)共檢測了β-內(nèi)酰胺類(mecA，femA)、四環(huán)素類(tetA)、喹諾酮類(norA)、酰胺醇類(cfr、fexA)和林可胺類(ermB)7種耐藥基因。耐藥基因檢出結(jié)果顯示，雞糞源葡萄球菌和豬糞源葡萄球菌耐藥基因攜帶率最高的是ermB。羊糞源葡萄球菌和牛糞源葡萄球菌耐藥基因檢測率最高的是femA。結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，羊糞源葡萄球菌、牛糞源葡萄球菌和豬糞源葡萄球菌耐藥基因檢出結(jié)果與耐藥結(jié)果基本一致，羊糞源葡萄球菌對(duì)被檢測的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物苯唑西林和頭孢噻呋的耐藥率超過50.0%；牛糞源葡萄球菌對(duì)被檢測的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物苯唑西林耐藥率高達(dá)59.4%，對(duì)頭孢噻呋的耐藥率也達(dá)到34.1%；而豬糞源葡萄球菌對(duì)被檢測的林可胺類抗菌藥物克林霉素的耐藥率高達(dá)74.2%，以上結(jié)果表明，耐藥基因的攜帶是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因之一。值得注意的是，雞糞源葡萄球菌對(duì)四環(huán)素類耐藥率最高，但四環(huán)素類耐藥基因tetA檢出率未超過10.0%，對(duì)被檢測的林可胺類抗菌藥物(克林霉素)的耐藥率僅為18.5%，但林可胺類耐藥基因ermB的檢出率卻最高，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是雞糞源葡萄球菌對(duì)四環(huán)素的耐藥不是由四環(huán)素耐藥基因tetA所介導(dǎo)，可能存在其他未檢測的耐藥基因(如tetB)，甚至是存在新的耐藥機(jī)制。耐藥基因共存結(jié)果顯示，除羊糞源葡萄球菌，其他3種動(dòng)物糞源葡萄球菌均以ermB+fexA基因共存為主，這與3種動(dòng)物源葡萄球菌對(duì)林可胺類和酰胺醇類抗菌藥物耐藥程度呈正比關(guān)系。

4 結(jié) 論

霍城地區(qū)不同動(dòng)物糞源葡萄球菌對(duì)被檢抗菌藥物耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)被檢抗菌藥物的耐藥率在3.0%～93.0%，耐藥程度由高到低依次為豬糞源葡萄球菌>雞糞源葡萄球菌>羊糞源葡萄球菌>牛糞源葡萄球菌，多藥耐藥情況嚴(yán)重，且存在多種耐藥基因共存情況，以攜帶ermB和femA基因?yàn)橹?。新疆霍城縣不同動(dòng)物糞源葡萄球菌在治療細(xì)菌性疾病時(shí)，需慎用酰胺醇類及林可胺類藥物，合理交替輪換使用抗生素有利于縮短治療周期，提高治療效果，亦能有效減少耐藥菌的產(chǎn)生。