茶多酚對H9C2大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用機制

陳立慧，李璐璐

0 引 言

缺血性心肌病在臨床上高發(fā)，而溶栓或介入等再灌注治療是目前治療缺血性心肌病的最佳方法，但缺血的心肌細(xì)胞在恢復(fù)血供后仍會發(fā)生心肌細(xì)胞損傷加重甚至死亡的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)，導(dǎo)致患者心功能障礙甚至是致死性心律失常[1]。雖然導(dǎo)致心肌細(xì)胞IRI的機制復(fù)雜，但是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在心肌IRI發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。茶多酚是一類從茶葉中提取的多酚類復(fù)合物，由于其來源廣泛，且使用安全，引起了越來越多的關(guān)注和研究[2]。多項研究證實，茶多酚具有強大的抗氧化和抗炎能力，目前已有報道其在降壓、降脂等保護心血管方面具有很好的作用[3]，另有研究表明，茶多酚具有改善胰島素抵抗、抗輻射、抗病毒、抑菌及抗病毒等藥理學(xué)作用[4-5]。

本實驗開展時間為2017年12月至2019年3月，我們利用缺氧孵箱和常規(guī)孵箱交替模擬缺血再灌注環(huán)境培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞，觀察茶多酚處理后缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞的細(xì)胞活性，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等氧化還原指標(biāo)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎癥指標(biāo)含量變化和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路中p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2)和p65表達(dá)情況，研究其對心肌缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用，為心肌IRI的防治提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料茶多酚(中國上海源葉生物科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)、胰蛋白酶(美國Gibco)、胎牛血清(美國Gibco)，CCK-8(美國Sigma)，MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒、MPO試劑盒、IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒和IL-6試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國Jackson公司，抗P-P38抗體、抗P38抗體、抗P-ERK抗體、抗ERK1/2抗體、抗P-JNK抗體、抗JNK 抗體、抗P65抗體和抗β-actin抗體購自美國Abcam公司；缺氧孵箱(德國賀氏)，分光光度計(中國蘇州威福光電)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院，選擇3～8代細(xì)胞用做實驗。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃的常氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞，隔天換液。細(xì)胞生長至80%時用以實驗[6]。

1.2.2 實驗分組及給藥按照隨機數(shù)表法將細(xì)胞分為對照組、缺氧/復(fù)氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組。經(jīng)過0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL這5個濃度梯度茶多酚的作用，檢測細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)2 mg/mL和4 mg/mL的茶多酚對H9C2大鼠心肌細(xì)胞活性無顯著影響，這與文獻[4-5,7]報道一致。對照組予以上述細(xì)胞培養(yǎng)方法，常規(guī)孵箱培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧組利用缺氧孵箱和常規(guī)孵箱交替模擬缺血再灌注環(huán)境培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞，具體為：利用缺氧孵箱(氧濃度為3%)培養(yǎng)細(xì)胞4 h(模擬細(xì)胞缺血狀態(tài))后放入常規(guī)孵箱(氧濃度為21%)繼續(xù)培養(yǎng)4 h(模擬細(xì)胞缺血后再灌注狀態(tài)),以此方法建立IRI細(xì)胞模型[8-10]。低濃度和高濃度茶多酚組處理H9C2大鼠心肌細(xì)胞時，在缺氧孵箱培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞4 h后，分別更換為含有2 mg/mL和4 mg/mL茶多酚的培養(yǎng)基，放入常規(guī)孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活性將H9C2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，加入CCK-8反應(yīng)48 h后用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度。以對照組的吸光度均值為100%，計算其余各組細(xì)胞活性[11]。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的檢測按照上述各試劑盒說明，在培養(yǎng)48 h后取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液，加入反應(yīng)試劑后利用酶標(biāo)儀檢測不同波長下各樣本的吸光度，以此計算MDA、SOD、CAT、GSH-Px、MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6等指標(biāo)的含量[7]。

1.2.5 免疫印跡檢測蛋白含量按照上述分組在6孔板中培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞，待到細(xì)胞融合度在80%左右時，每孔加入50 μL含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液裂解培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞，收集裂解液于離心管中，15 000 r/min低溫離心15 min(有效離心半徑為10 cm)，利用蛋白濃度檢測試劑盒檢測所提取蛋白的濃度，按照1∶3比例混合上樣緩沖液和蛋白，煮沸上述蛋白樣本后進行電泳；每個孔上樣40 μg上述煮沸后的蛋白樣本，以90 V電壓進行電泳，保持30 min后改為120 V，90 min后電泳結(jié)束后以250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，隨后利用鹽水緩沖液稀釋的5%的脫脂奶粉封閉液(5 g/100 mL)封閉，隨后按照相應(yīng)的濃度配制抗體(P-P38、P38、P-ERK1/2、ERK1/2、P-JNK、JNK、P65和β-actin)對醋酸纖維素膜分別進行4 ℃過夜孵育，利用鹽水緩沖液洗膜5 min×3次后利用1∶10 000濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后進行發(fā)光檢測[11]。

2 結(jié) 果

2.1 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞活性的影響與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細(xì)胞活性減弱(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，茶多酚組細(xì)胞活性增強(P<0.05)，但未恢復(fù)到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖1。

1：對照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組與對照組比較，*P<0.05；與缺氧/復(fù)氧組比較，#P<0.05圖1 利用CCK-8法檢測茶多酚對缺氧/復(fù)氧后H9C2大鼠心肌細(xì)胞活性的影響

2.2 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細(xì)胞MDA含量增加(P<0.05)，而SOD、CAT和GSH-Px含量均降低(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，茶多酚組細(xì)胞MDA含量降低(P<0.05)，SOD、CAT和GSH-Px含量增加(P<0.05), 但均未恢復(fù)到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖2。

1：對照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組與對照組比較，*P<0.05；與缺氧/復(fù)氧組比較，#P<0.05圖2 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子的影響與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細(xì)胞MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6含量均增加(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，茶多酚組細(xì)胞MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6含量減少(P<0.05), 但均未恢復(fù)到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖3。

1：對照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組與對照組比較，*P<0.05；與缺氧/復(fù)氧組比較，#P<0.05圖3 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子的影響

2.4 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細(xì)胞P-P38、P-ERK、P-JNK和P65表達(dá)均增加(P<0.05)；與缺氧/復(fù)氧組相比，茶多酚組細(xì)胞P-P38、P-ERK、P-JNK和P65表達(dá)減少(P<0.05), 但均未恢復(fù)到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖4、圖5。

1：對照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組圖4 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

1：對照組；2：缺氧/復(fù)氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與缺氧/復(fù)氧組比較，#P<0.05，##P<0.01圖5 茶多酚對缺氧/復(fù)氧損傷H9C2大鼠心肌細(xì)胞MAPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

目前IRI的細(xì)胞模型主要是利用耗氧劑連二亞硫酸鈉除去培養(yǎng)液中氧,模擬組織細(xì)胞缺血缺氧?，F(xiàn)有的IRI細(xì)胞模型利用含有連二亞硫酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)模擬缺血和再灌注的方法處理H9C2大鼠心肌

細(xì)胞，但慮到連二亞硫酸鈉作用時只是部分模擬組織細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，并不是真正狀態(tài)下的組織細(xì)胞缺氧，而是通過抑制細(xì)胞內(nèi)部分呼吸酶模擬缺氧效果，且連二亞硫酸鈉對細(xì)胞的毒性作用較強，對細(xì)胞活性影響較大[12]。相反，通過缺氧孵箱來模擬缺血再灌注模型可以完全避免上述問題，其通過控制培養(yǎng)細(xì)胞過程中的氧氣含量，很好的模擬了缺血狀態(tài)對細(xì)胞的生物學(xué)影響，而且其濃度恒定，操作簡單，容易控制[13]。

IRI能夠激活生物膜的脂質(zhì)過氧化作用，而MDA可被作為是氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)；正常情況下，組織內(nèi)CAT、SOD和GSH-Px發(fā)揮著防止細(xì)胞過氧化的重要作用，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生IRI時，氧自由基產(chǎn)生增加，CAT、SOD和GSH-Px等物質(zhì)和產(chǎn)生的自由基迅速結(jié)合而含量急劇減少，故此時細(xì)胞的抗氧化能力下降，使得細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)發(fā)生過氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷不可逆，直至細(xì)胞死亡，因而CAT、SOD和GSH-Px的活性可以反映細(xì)胞清除自由基的能力[14-15]。本實驗結(jié)果表明茶多酚能夠降低IRI誘導(dǎo)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞中MDA含量及增加CAT、SOD和GSH-Px的活性減。本研究和其他一些茶多酚抗氧化的研究相似，Wang等[16]的研究表明茶多酚能夠通過抗氧化作用減輕四氯化碳造成的小鼠肝損傷。Qian等[17]發(fā)現(xiàn)茶多酚可以通過其抗氧化作用減輕乙醇造成的胃黏膜損傷。Cong等[18]證實茶多酚可通過其抗氧化及抗凋亡作用抑制原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的谷氨酸興奮性毒性。

心肌發(fā)生IRI時能夠促進心肌細(xì)胞產(chǎn)生和釋放多種炎性介質(zhì)，包括MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6等[14-18]，本實驗結(jié)果表明茶多酚能夠降低H9C2大鼠心肌細(xì)胞中MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥因子的含量。本研究和其他一些茶多酚抗炎的研究相似，潘妍霓等[19]研究表明，茶多酚能夠通過TNF-α、NF-κB、IL-1β的表達(dá)發(fā)揮對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用。沈海濤等[20]發(fā)現(xiàn)，茶多酚干預(yù)可通過減輕腎臟中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)對百草枯中毒大鼠腎臟有保護作用。王曉芹等[21]發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以通過減輕炎癥反應(yīng)和增強機體抗氧化能力改善大鼠胰島素抵抗。

在組織發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)過程中NF-κB和MAPK信號通路可被激活，多種IRI中都已發(fā)現(xiàn)p38、JNK、ERK1/2和p65通路激活[22-23]。本實驗中也觀察到相似現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)H9C2大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生IRI時p38、JNK、ERK1/2和p65通路被激活，而茶多酚能夠有效抑制這些通路的活化，從而發(fā)揮抗氧化及抗炎作用，進而發(fā)揮對H9C2大鼠心肌細(xì)胞IRI的保護作用。

本實驗雖在離體細(xì)胞學(xué)實驗上觀察到了茶多酚對H9C2大鼠心肌細(xì)胞IRI的保護作用，但是尚未進行在體實驗，下一步我們將在體繼續(xù)研究茶多酚對心肌IRI的保護作用，為進一步研究心肌IRI的防治提供更為確切的實驗基礎(chǔ)。