燈盞乙素苷元對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌張力影響及作用機(jī)制研究

胡 燦，張一鳴，繆志敏，賴 泳

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

燈盞乙素是從云貴高原菊科飛蓬屬植物短葶飛 蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.（燈 盞花）中提取的總黃酮類化合物燈盞花素的有效成分，其對(duì)腦血栓、冠心病等心腦血管疾病具有良好療效〔1-4〕。目前絕大多數(shù)研究都是集中在藥理作用、心腦血管疾病的臨床應(yīng)用方面，而在對(duì)治療支氣管哮喘疾病方面的研究較少。支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是呼吸內(nèi)科常見(jiàn)病〔5-6〕。臨床治療主要以平喘、抗炎、解痙為主，但是副作用大，復(fù)發(fā)率較高，多數(shù)患者都不能徹底根治。研究表明燈盞花素治療哮喘療效良好〔7〕，另外，李慧萍等〔8〕發(fā)現(xiàn)燈盞花素對(duì)離體豚鼠肺間質(zhì)條平滑肌有松弛作用。也有研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素治療支氣管哮喘療效顯著，無(wú)明顯不良反應(yīng)〔9〕，提示燈盞乙素對(duì)哮喘有一定治療作用?？诜舯K乙素的藥動(dòng)學(xué)研究顯示只有1%左右的原型被吸收，其主要經(jīng)腸道細(xì)菌代謝后以苷元的形式進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮作用〔10〕，且燈盞乙素本身在體內(nèi)消除迅速，不適于經(jīng)靜脈途徑給藥。本實(shí)驗(yàn)以燈盞乙素苷元為受試藥對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌張力影響進(jìn)行研究，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，為支氣管哮喘的治療提供新的途徑，并為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及利用燈盞花提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物與試劑燈盞乙素苷元（云南植物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：15031221）；磷酸組胺（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：15067162）；毛果蕓香堿（北京第二制藥廠，批號(hào)：15026579）；KCl（天津市化學(xué)試劑一廠）；茶堿緩釋膠囊（海南普利制藥股份有限公司，批號(hào)：14127523）；克氏液（每1 000 mL含NaCl 6.9 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，NaHCO32.1 g，CaCl20.28 g，葡萄糖2 g）；無(wú)鈣克氏液（每1 000 mL含NaCl 6.9 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，NaHCO32.1 g，葡萄糖2 g），均為市售分析純。

1.2動(dòng)物豚鼠，普通級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量（300±50）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.3儀器BL-420E+型生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)、張力換能器（成都泰盟軟件有限公司）；HW-400S恒溫平滑肌槽（成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1燈盞乙素苷元溶液的制備稱取燈盞乙素苷元粉末0.5 g，分別用3 mL克氏液和無(wú)鈣克氏液溶解，過(guò)濾，備用。

2.2豚鼠離體支氣管平滑肌標(biāo)本的制備將豚鼠擊頭處死后迅速取出支氣管，浸沒(méi)于通有氧氣的克氏液中，剪除支氣管周圍的結(jié)締組織后將其制成螺旋條，放入盛有經(jīng)（37±0.5）℃預(yù)熱20 mL克氏液的恒溫浴槽中，并通入95%O2及5%CO2混合氣體。將離體支氣管與張力換能器相連，生理記錄儀記錄肌張力的變化。標(biāo)本初始負(fù)荷張力1.5 g，每20 min換1次液，穩(wěn)定60 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)〔11〕。

2.3燈盞乙素苷元對(duì)豚鼠正常離體支氣管平滑肌的影響豚鼠離體支氣管標(biāo)本穩(wěn)定后，加入燈盞乙素苷元溶液，使恒溫浴槽中的最終質(zhì)量濃度依次為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組0.150 g/L茶堿和溶劑對(duì)照組。觀察給藥后10 min內(nèi)的支氣管張力下降幅度，計(jì)算舒張率。

舒張率=（給藥前張力高度-給藥后張力高度）/給藥前張力高度×100%。

2.4燈盞乙素苷元對(duì)磷酸組胺預(yù)收縮支氣管平滑肌張力的作用以0.300 mg/L磷酸組胺預(yù)收縮支氣管平滑肌，待支氣管平滑肌收縮達(dá)到穩(wěn)定后，累積加入燈盞乙素苷元，使恒溫浴槽中的燈盞乙素苷元質(zhì) 量 濃度 依次 遞 增為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設(shè)0.150 g/L茶堿陽(yáng)性對(duì)照組及溶劑對(duì)照組，觀察支氣管平滑肌的舒張反應(yīng)。

2.5燈盞乙素苷元對(duì)毛果蕓香堿預(yù)收縮支氣管平滑肌的作用以0.760 mg/L毛果蕓香堿預(yù)收縮支氣管平滑肌，待支氣管平滑肌收縮達(dá)到穩(wěn)定后，累積加入燈盞乙素苷元，使恒溫浴槽中的燈盞乙素苷元質(zhì)量濃度依次遞增為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設(shè)0.150 g/L茶堿陽(yáng)性對(duì)照組及溶劑對(duì)照組，觀察支氣管平滑肌的舒張反應(yīng)。

2.6燈盞乙素苷元對(duì)KCl預(yù)收縮支氣管平滑肌的作用以0.610 mg/L KCl預(yù)收縮支氣管平滑肌，待支氣管平滑肌收縮達(dá)到穩(wěn)定后，累積加入燈盞乙素苷元，使恒溫浴槽中的燈盞乙素苷元質(zhì)量濃度依次遞增為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設(shè)0.150 g/L茶堿陽(yáng)性對(duì)照組及溶劑對(duì)照組，觀察支氣管平滑肌的舒張反應(yīng)。

2.7無(wú)鈣條件下燈盞乙素苷元對(duì)支氣管平滑肌的作用在無(wú)鈣克氏液條件下，重復(fù)“2.4”“2.5”的操作。

2.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1燈盞乙素苷元對(duì)豚鼠正常離體支氣管的影響與對(duì)照組相比，0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元對(duì)靜息狀態(tài)下豚鼠離體支氣管平滑肌張力均具有舒張作用，舒張率分別為（4.610±0.038）%、（4.220±0.022）%、（3.310±0.023）%、（3.900±0.030）%、（6.170±0.026）%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 燈盞乙素苷元對(duì)豚鼠正常離體支氣管平滑肌張力的影響（±s,n=10）

3.2磷酸組胺、毛果蕓香堿和KCl分別聯(lián)合燈盞乙素苷元對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌在含鈣及無(wú)鈣條件下的影響加入磷酸組胺終濃度為0.300 mg/L時(shí)，引起豚鼠離體支氣管平滑肌收縮，聯(lián)合0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元后在有鈣條件下舒張率分別為（35.600±0.021）%、（37.200±0.023）%、（39.200±0.018）%、（40.400±0.024）%、（42.000±0.017）%；在無(wú)鈣條件下，磷酸組胺聯(lián)合0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元舒張率分別為（19.300±0.011）%、（22.350±0.021）%、（24.580±0.015）%、（29.050±0.024）%、（32.400±0.023）%。見(jiàn)表1。加入毛果蕓香堿終濃度為0.760 mg/L時(shí)，引起豚鼠離體支氣管平滑肌收縮，聯(lián)合0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元后在有鈣條件下舒張率分別為（16.180±0.028）%、（16.760±0.027）%、（16.760±0.027）%、（18.500±0.028）%、（19.010±0.026）%；在無(wú)鈣條件下，0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元聯(lián)合毛果蕓香堿舒張率分別為（1.580±0.031）%、（10.050±0.028）%、（15.340±0.029）%、（25.390±0.033）%、（28.570±0.030）%。見(jiàn)表2。加入KCl終濃度為0.610 mg/L時(shí)，引起豚鼠離體支氣管平滑肌收縮，聯(lián)合燈盞乙素苷元后未見(jiàn)豚鼠離體支氣管平滑肌舒張。見(jiàn)表3。

表1 燈盞乙素苷元聯(lián)合磷酸組胺對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌的作用

表1 燈盞乙素苷元聯(lián)合磷酸組胺對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌的作用

注：與溶劑對(duì)照組比較*P＜0.05；與磷酸組胺組比較△P＜0.05。

表2 燈盞乙素苷元聯(lián)合毛果蕓香堿對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（

表2 燈盞乙素苷元聯(lián)合毛果蕓香堿對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（

注：與溶劑對(duì)照組比較*P＜0.05；與毛果蕓香堿組比較△P＜0.05。

表3 燈盞乙素苷元聯(lián)合KCl對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（s,n=10）

表3 燈盞乙素苷元聯(lián)合KCl對(duì)豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（s,n=10）

注：與溶劑對(duì)照組比較*P＜0.05。

4 討論

燈盞花素是由燈盞花甲素和燈盞花乙素（又名野黃芩苷）組成的混合物。因其藥理作用較多，目前已在臨床上廣泛應(yīng)用。但對(duì)其研究主要集中在心腦血管疾病，而在呼吸系統(tǒng)方面的研究報(bào)道卻較少。燈盞花素粉針劑治療支氣管哮喘的臨床療效已經(jīng)得到驗(yàn)證〔9〕。燈盞乙素苷元是口服燈盞乙素后經(jīng)腸道菌群作用產(chǎn)生的活性成分，本實(shí)驗(yàn)在豚鼠離體支氣管平滑肌的張力檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素苷元對(duì)靜息狀態(tài)下豚鼠離體支氣管平滑肌有明顯的舒張作用，并且在質(zhì)量濃度為0.152～0.610 g/L時(shí)表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。

支氣管平滑肌上受體主要有組胺受體（H受體）、膽堿受體（M受體）和腎上腺素受體，磷酸組胺和毛果蕓香堿分別作用于H1、M受體引起豚鼠離體支氣管平滑肌痙攣。為了進(jìn)一步研究燈盞乙素苷元舒張豚鼠支氣管平滑肌的機(jī)制，我們分別檢測(cè)了在含鈣及無(wú)鈣條件下，磷酸組胺、毛果蕓香堿聯(lián)合燈盞乙素苷元作用于豚鼠離體支氣管平滑肌后，其張力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)燈盞乙素苷元可以使磷酸組胺、毛果蕓香堿誘導(dǎo)的平滑肌收縮的張力變小并且有濃度依賴性，在無(wú)鈣條件下依然得到同樣的結(jié)果，但和有鈣條件下比較差異不明顯。表明燈盞乙素苷元可能通過(guò)影響組胺受體及膽堿受體，起到舒張支氣管平滑肌的作用。

研究表明，在支氣管平滑肌收縮反應(yīng)中，細(xì)胞胞漿內(nèi)的Ca2+起著關(guān)鍵作用。此外，支氣管平滑肌細(xì)胞膜上存在電壓依賴性鈣通道（VDC）〔12〕。VDC可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入胞漿內(nèi)，從而啟動(dòng)興奮-收縮耦聯(lián)過(guò)程。哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞膜上的鈣通道開(kāi)放增加，增加胞漿內(nèi)Ca2+濃度可使哮喘患者的氣道平滑肌處于無(wú)收縮的活性增加狀態(tài)。雖然此時(shí)氣道平滑肌沒(méi)有開(kāi)始收縮，但卻可以增加氣管平滑肌的活性，使其處于高敏感狀態(tài)，從而使氣道處于高反應(yīng)性，輕微的刺激都容易誘發(fā)氣道的痙攣。鉀離子通道（IK）在自然界廣泛存在。IK在細(xì)胞去極化后的興奮性恢復(fù)及維持中均起重要的作用。Panthiya等〔13〕發(fā)現(xiàn)茶、氨基吡啶（4-AP）阻斷IK可引起氣管平滑肌興奮性增加，KCl可使細(xì)胞膜發(fā)生除極化，繼而使VDC被激活〔14〕；同時(shí)KCl可增加平滑肌細(xì)胞對(duì)Ca2+的收縮敏感性〔15〕，本研究結(jié)果顯示燈盞乙素苷元對(duì)KCl誘導(dǎo)的痙攣狀態(tài)豚鼠離體支氣管平滑肌張力無(wú)影響，提示燈盞乙素苷元舒張豚鼠離體支氣管平滑肌的作用可能與K+和Ca2+通道無(wú)關(guān)。

以上結(jié)果表明，燈盞乙素苷元對(duì)靜息狀態(tài)及致痙劑處理的豚鼠離體支氣管平滑肌具有舒張作用；作用機(jī)制可能與阻斷組胺受體和膽堿受體有關(guān)，與K+和Ca2+通道無(wú)關(guān)。這為其進(jìn)一步的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，由于離體實(shí)驗(yàn)脫離生理環(huán)境，有一定局限性，故此實(shí)驗(yàn)結(jié)論尚需經(jīng)過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步的驗(yàn)證。