燈盞乙素苷元對豚鼠離體支氣管平滑肌張力影響及作用機制研究

胡 燦，張一鳴，繆志敏，賴 泳

（大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000）

燈盞乙素是從云貴高原菊科飛蓬屬植物短葶飛 蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand-Mazz.（燈 盞花）中提取的總黃酮類化合物燈盞花素的有效成分，其對腦血栓、冠心病等心腦血管疾病具有良好療效〔1-4〕。目前絕大多數(shù)研究都是集中在藥理作用、心腦血管疾病的臨床應用方面，而在對治療支氣管哮喘疾病方面的研究較少。支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是呼吸內科常見病〔5-6〕。臨床治療主要以平喘、抗炎、解痙為主，但是副作用大，復發(fā)率較高，多數(shù)患者都不能徹底根治。研究表明燈盞花素治療哮喘療效良好〔7〕，另外，李慧萍等〔8〕發(fā)現(xiàn)燈盞花素對離體豚鼠肺間質條平滑肌有松弛作用。也有研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素治療支氣管哮喘療效顯著，無明顯不良反應〔9〕，提示燈盞乙素對哮喘有一定治療作用。口服燈盞乙素的藥動學研究顯示只有1%左右的原型被吸收，其主要經腸道細菌代謝后以苷元的形式進入體內并發(fā)揮作用〔10〕，且燈盞乙素本身在體內消除迅速，不適于經靜脈途徑給藥。本實驗以燈盞乙素苷元為受試藥對豚鼠離體支氣管平滑肌張力影響進行研究，并對其機制進行初步探討，為支氣管哮喘的治療提供新的途徑，并為進一步開發(fā)及利用燈盞花提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1藥物與試劑燈盞乙素苷元（云南植物藥業(yè)有限公司，批號：15031221）；磷酸組胺（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號：15067162）；毛果蕓香堿（北京第二制藥廠，批號：15026579）；KCl（天津市化學試劑一廠）；茶堿緩釋膠囊（海南普利制藥股份有限公司，批號：14127523）；克氏液（每1 000 mL含NaCl 6.9 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，NaHCO32.1 g，CaCl20.28 g，葡萄糖2 g）；無鈣克氏液（每1 000 mL含NaCl 6.9 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，NaHCO32.1 g，葡萄糖2 g），均為市售分析純。

1.2動物豚鼠，普通級，雌雄不限，體質量（300±50）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。

1.3儀器BL-420E+型生物信號采集與分析系統(tǒng)、張力換能器（成都泰盟軟件有限公司）；HW-400S恒溫平滑肌槽（成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

2.1燈盞乙素苷元溶液的制備稱取燈盞乙素苷元粉末0.5 g，分別用3 mL克氏液和無鈣克氏液溶解，過濾，備用。

2.2豚鼠離體支氣管平滑肌標本的制備將豚鼠擊頭處死后迅速取出支氣管，浸沒于通有氧氣的克氏液中，剪除支氣管周圍的結締組織后將其制成螺旋條，放入盛有經（37±0.5）℃預熱20 mL克氏液的恒溫浴槽中，并通入95%O2及5%CO2混合氣體。將離體支氣管與張力換能器相連，生理記錄儀記錄肌張力的變化。標本初始負荷張力1.5 g，每20 min換1次液，穩(wěn)定60 min后開始實驗〔11〕。

2.3燈盞乙素苷元對豚鼠正常離體支氣管平滑肌的影響豚鼠離體支氣管標本穩(wěn)定后，加入燈盞乙素苷元溶液，使恒溫浴槽中的最終質量濃度依次為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設陽性對照組0.150 g/L茶堿和溶劑對照組。觀察給藥后10 min內的支氣管張力下降幅度，計算舒張率。

舒張率=（給藥前張力高度-給藥后張力高度）/給藥前張力高度×100%。

2.4燈盞乙素苷元對磷酸組胺預收縮支氣管平滑肌張力的作用以0.300 mg/L磷酸組胺預收縮支氣管平滑肌，待支氣管平滑肌收縮達到穩(wěn)定后，累積加入燈盞乙素苷元，使恒溫浴槽中的燈盞乙素苷元質 量 濃度 依次 遞 增為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設0.150 g/L茶堿陽性對照組及溶劑對照組，觀察支氣管平滑肌的舒張反應。

2.5燈盞乙素苷元對毛果蕓香堿預收縮支氣管平滑肌的作用以0.760 mg/L毛果蕓香堿預收縮支氣管平滑肌，待支氣管平滑肌收縮達到穩(wěn)定后，累積加入燈盞乙素苷元，使恒溫浴槽中的燈盞乙素苷元質量濃度依次遞增為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設0.150 g/L茶堿陽性對照組及溶劑對照組，觀察支氣管平滑肌的舒張反應。

2.6燈盞乙素苷元對KCl預收縮支氣管平滑肌的作用以0.610 mg/L KCl預收縮支氣管平滑肌，待支氣管平滑肌收縮達到穩(wěn)定后，累積加入燈盞乙素苷元，使恒溫浴槽中的燈盞乙素苷元質量濃度依次遞增為0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L，另設0.150 g/L茶堿陽性對照組及溶劑對照組，觀察支氣管平滑肌的舒張反應。

2.7無鈣條件下燈盞乙素苷元對支氣管平滑肌的作用在無鈣克氏液條件下，重復“2.4”“2.5”的操作。

2.8數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1燈盞乙素苷元對豚鼠正常離體支氣管的影響與對照組相比，0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元對靜息狀態(tài)下豚鼠離體支氣管平滑肌張力均具有舒張作用，舒張率分別為（4.610±0.038）%、（4.220±0.022）%、（3.310±0.023）%、（3.900±0.030）%、（6.170±0.026）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 燈盞乙素苷元對豚鼠正常離體支氣管平滑肌張力的影響（±s,n=10）

3.2磷酸組胺、毛果蕓香堿和KCl分別聯(lián)合燈盞乙素苷元對豚鼠離體支氣管平滑肌在含鈣及無鈣條件下的影響加入磷酸組胺終濃度為0.300 mg/L時，引起豚鼠離體支氣管平滑肌收縮，聯(lián)合0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元后在有鈣條件下舒張率分別為（35.600±0.021）%、（37.200±0.023）%、（39.200±0.018）%、（40.400±0.024）%、（42.000±0.017）%；在無鈣條件下，磷酸組胺聯(lián)合0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元舒張率分別為（19.300±0.011）%、（22.350±0.021）%、（24.580±0.015）%、（29.050±0.024）%、（32.400±0.023）%。見表1。加入毛果蕓香堿終濃度為0.760 mg/L時，引起豚鼠離體支氣管平滑肌收縮，聯(lián)合0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元后在有鈣條件下舒張率分別為（16.180±0.028）%、（16.760±0.027）%、（16.760±0.027）%、（18.500±0.028）%、（19.010±0.026）%；在無鈣條件下，0.038、0.076、0.152、0.305、0.610 g/L燈盞乙素苷元聯(lián)合毛果蕓香堿舒張率分別為（1.580±0.031）%、（10.050±0.028）%、（15.340±0.029）%、（25.390±0.033）%、（28.570±0.030）%。見表2。加入KCl終濃度為0.610 mg/L時，引起豚鼠離體支氣管平滑肌收縮，聯(lián)合燈盞乙素苷元后未見豚鼠離體支氣管平滑肌舒張。見表3。

表1 燈盞乙素苷元聯(lián)合磷酸組胺對豚鼠離體支氣管平滑肌的作用

表1 燈盞乙素苷元聯(lián)合磷酸組胺對豚鼠離體支氣管平滑肌的作用

注：與溶劑對照組比較*P＜0.05；與磷酸組胺組比較△P＜0.05。

表2 燈盞乙素苷元聯(lián)合毛果蕓香堿對豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（

表2 燈盞乙素苷元聯(lián)合毛果蕓香堿對豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（

注：與溶劑對照組比較*P＜0.05；與毛果蕓香堿組比較△P＜0.05。

表3 燈盞乙素苷元聯(lián)合KCl對豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（s,n=10）

表3 燈盞乙素苷元聯(lián)合KCl對豚鼠離體支氣管平滑肌的作用（s,n=10）

注：與溶劑對照組比較*P＜0.05。

4 討論

燈盞花素是由燈盞花甲素和燈盞花乙素（又名野黃芩苷）組成的混合物。因其藥理作用較多，目前已在臨床上廣泛應用。但對其研究主要集中在心腦血管疾病，而在呼吸系統(tǒng)方面的研究報道卻較少。燈盞花素粉針劑治療支氣管哮喘的臨床療效已經得到驗證〔9〕。燈盞乙素苷元是口服燈盞乙素后經腸道菌群作用產生的活性成分，本實驗在豚鼠離體支氣管平滑肌的張力檢測中發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素苷元對靜息狀態(tài)下豚鼠離體支氣管平滑肌有明顯的舒張作用，并且在質量濃度為0.152～0.610 g/L時表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。

支氣管平滑肌上受體主要有組胺受體（H受體）、膽堿受體（M受體）和腎上腺素受體，磷酸組胺和毛果蕓香堿分別作用于H1、M受體引起豚鼠離體支氣管平滑肌痙攣。為了進一步研究燈盞乙素苷元舒張豚鼠支氣管平滑肌的機制，我們分別檢測了在含鈣及無鈣條件下，磷酸組胺、毛果蕓香堿聯(lián)合燈盞乙素苷元作用于豚鼠離體支氣管平滑肌后，其張力的變化，結果發(fā)現(xiàn)燈盞乙素苷元可以使磷酸組胺、毛果蕓香堿誘導的平滑肌收縮的張力變小并且有濃度依賴性，在無鈣條件下依然得到同樣的結果，但和有鈣條件下比較差異不明顯。表明燈盞乙素苷元可能通過影響組胺受體及膽堿受體，起到舒張支氣管平滑肌的作用。

研究表明，在支氣管平滑肌收縮反應中，細胞胞漿內的Ca2+起著關鍵作用。此外，支氣管平滑肌細胞膜上存在電壓依賴性鈣通道（VDC）〔12〕。VDC可以調節(jié)細胞外Ca2+進入胞漿內，從而啟動興奮-收縮耦聯(lián)過程。哮喘患者氣道平滑肌細胞膜上的鈣通道開放增加，增加胞漿內Ca2+濃度可使哮喘患者的氣道平滑肌處于無收縮的活性增加狀態(tài)。雖然此時氣道平滑肌沒有開始收縮，但卻可以增加氣管平滑肌的活性，使其處于高敏感狀態(tài)，從而使氣道處于高反應性，輕微的刺激都容易誘發(fā)氣道的痙攣。鉀離子通道（IK）在自然界廣泛存在。IK在細胞去極化后的興奮性恢復及維持中均起重要的作用。Panthiya等〔13〕發(fā)現(xiàn)茶、氨基吡啶（4-AP）阻斷IK可引起氣管平滑肌興奮性增加，KCl可使細胞膜發(fā)生除極化，繼而使VDC被激活〔14〕；同時KCl可增加平滑肌細胞對Ca2+的收縮敏感性〔15〕，本研究結果顯示燈盞乙素苷元對KCl誘導的痙攣狀態(tài)豚鼠離體支氣管平滑肌張力無影響，提示燈盞乙素苷元舒張豚鼠離體支氣管平滑肌的作用可能與K+和Ca2+通道無關。

以上結果表明，燈盞乙素苷元對靜息狀態(tài)及致痙劑處理的豚鼠離體支氣管平滑肌具有舒張作用；作用機制可能與阻斷組胺受體和膽堿受體有關，與K+和Ca2+通道無關。這為其進一步的研究提供了實驗依據(jù)，由于離體實驗脫離生理環(huán)境，有一定局限性，故此實驗結論尚需經過體內試驗進一步的驗證。