黑果腺肋花楸組培快繁技術(shù)研究

劉 行， 夏 群， 張成霞， 居 濤， 王 瑞， 袁季平，獨(dú)居想， 陳 麗， 紀(jì)曉曉

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 園林園藝學(xué)院， 江蘇 泰州 225300；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院, 河北 保定 071000)

黑果腺肋花楸(AroniamelanocarpaElliot)為薔薇科腺肋花楸屬落葉小灌木，樹型優(yōu)美，葉色多變，復(fù)傘房花序，花期20 d，暗紅色漿果，可冬季宿存于樹上，且富含抗氧化物質(zhì)，具有醫(yī)藥價(jià)值，另外，果實(shí)可加工成果醬、果汁等口味獨(dú)特的食品，是可四季觀賞兼藥用食用價(jià)值的珍貴樹種[1-3]。在歐美地區(qū)，花楸屬植物在園林綠化中應(yīng)用較廣泛，且對(duì)其藥用食用功效也有所研究[4]，但在我國(guó)主要集中于其藥用價(jià)值方面的研究，而園林中花楸屬植物應(yīng)用較少，繁殖方面的研究更少。

黑果腺肋花楸的種子具有深休眠性，且收集和處理難，耗時(shí)長(zhǎng)，因而有性繁殖較困難[5]；其枝條木質(zhì)化程度高，生根困難，扦插成活率偏低，且受季節(jié)與環(huán)境的影響，扦插繁殖困難，且對(duì)扦插繁殖條件要求高，成本增加[6-9]；而組織培養(yǎng)繁殖方式，繁殖系數(shù)高，苗木繁育速度快，可在短時(shí)間內(nèi)解決市場(chǎng)苗木短缺問題。為提高組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)，選用黑果腺肋花楸嫩芽為外植體，以影響黑果腺肋花楸增殖生長(zhǎng)、生根培養(yǎng)、移栽馴化的因素為研究對(duì)象，以期篩選出最適宜的離體再生體系，為黑果腺肋花楸實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來源于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院中藥科技園引種栽培的黑果腺肋花楸。選取當(dāng)年生嫩芽作為組培外植體，并用流水沖洗干凈。沖洗后的嫩芽在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精分別浸泡40 min，無菌水沖洗3次，再用2%的次氯酸鈉(NaClO)浸泡12 min，浸泡過程中不斷攪動(dòng)，使外植體與NaClO充分接觸。再用無菌水沖洗5次(以上操作環(huán)節(jié)動(dòng)作要迅速)，之后接種于MS+1.0 mg·L-1BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.5 mg·L-1NAA(a-萘乙酸)+30 g·L-1蔗糖+0.5 g·L-1活性炭+7 g·L-1瓊脂(pH 5.8)的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度70%，光照1 600 lx，每天光照16 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1黑果腺肋花楸組培苗增殖培養(yǎng)的篩選

無菌條件下，將組培苗切取1 cm長(zhǎng)莖段轉(zhuǎn)接于MS+30 g·L-1蔗糖+0.5 g·L-1活性炭+7 g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基，6-BA濃度設(shè)置為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1，NAA濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-1，進(jìn)行2因素5水平的正交試驗(yàn)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度70%，光照1 600 lx，每天光照16 h。每個(gè)處理50個(gè)外植體，3次重復(fù)，其它培養(yǎng)條件與方法35 d后觀察組培苗增值及生長(zhǎng)情況。

增殖系數(shù)=增殖的苗數(shù)/接入的莖段數(shù)。

圖1 黑果腺肋花楸無菌苗

1.2.2黑果腺肋花楸組培苗生根培養(yǎng)基的篩選

試驗(yàn)設(shè)計(jì)MS培養(yǎng)基濃度、NAA濃度對(duì)黑果腺肋花楸生根的影響。將黑果腺肋花楸組培苗在無菌條件下切成1.5 cm左右，分別接種于不同處理的培養(yǎng)基上，MS培養(yǎng)基濃度設(shè)置為1/4 MS、1/2 MS、3/4 MS、MS，NAA濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1，進(jìn)行正交試驗(yàn)，每瓶接入5個(gè)莖段，每處理重復(fù)3次，40 d后調(diào)查鮮重、干重、株高、根長(zhǎng)、根數(shù)、生根率等情況。其它培養(yǎng)條件同試驗(yàn)1.2.1。

生根率(%)=(生根植株數(shù)/接入的莖段數(shù))×100%。

1.2.3黑果腺肋花楸組培苗馴化的移栽基質(zhì)的篩選

當(dāng)黑果腺肋花楸組培苗長(zhǎng)出正常短根(≤1 cm)時(shí)，即可出瓶馴化。將組培苗開蓋，噴霧處理7 d后，移栽于50穴黑色育苗盤(54 cm×28 cm×4.8 cm，上口徑4.8 cm,下口徑2.3 cm)，選用不同基質(zhì)配比進(jìn)行組培苗的馴化(如表1)，觀察植株生長(zhǎng)狀況，調(diào)查成活率及生長(zhǎng)狀況。用透明塑料布覆蓋育苗盤表面，并每天噴霧3～5次，以保持濕度達(dá)85%以上。在中午光照強(qiáng)烈的情況下，采用遮陽網(wǎng)遮蔭。3 d后逐步撤去塑料布，30 d后移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中并移至室外條件進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，逐步撤去遮陽網(wǎng)，觀察并記錄植株的生長(zhǎng)狀況與成活率。

成活率(%)=(成活植株數(shù)/移栽植株數(shù))×100%。

表1 黑果腺肋花楸組培苗馴化移栽基質(zhì)篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理基質(zhì)種類基質(zhì)配比A蛭石∶草炭土1∶4B蛭石∶草炭土2∶3C蛭石∶草炭土3∶2D蛭石∶草炭土4∶1

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)處理和圖表制作應(yīng)用Excel軟件，方差分析采用SPSS 13.0軟件(p=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAA與6-BA不同濃度配比對(duì)黑果腺肋花楸增殖的影響

2.1.16-BA不同濃度配比對(duì)黑果腺肋花楸增殖的影響

從表2可看出，在同一NAA濃度下，6-BA濃度在0.1～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，隨6-BA濃度增加，組培苗的增殖系數(shù)增加，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，達(dá)到最大值，顯著高于其他處理，且植株的鮮重、干重、株高均顯著高于6-BA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，葉片伸展。隨6-BA濃度增加至濃度1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)逐漸下降，植株玻璃化現(xiàn)象逐步嚴(yán)重，植株矮小，長(zhǎng)勢(shì)弱。綜合比較，黑果腺肋花楸增殖生長(zhǎng)最適宜的6-BA濃度為1.0 mg·L-1。

表2 6-BA濃度對(duì)黑果腺肋花楸增殖的影響

激素NAA濃度/(mg·L-1)6-BA濃度/(mg·L-1)鮮重/mg干重/mg株高/cm增殖系數(shù)0.10.1337.9c42.8c2.42d 1.29e0.5407.5b63.6b3.03c3.05d1.0519.5a73.8a3.93a6.16a1.5508.5a66.6ab3.33b 4.84b2.0316.9d35.8c3.07c4.55c0.20.1598.0c84.7c3.94c4.42e0.5613.9bc95.2ab4.09bc4.82d1.0679.0a100.5a4.77a6.93a1.5655.1a90.5bc4.42b6.33b2.0627.2b87.2bc4.13bc5.94c0.30.1699.0d108.6d4.74d5.56d 0.5703.8cd107.5d4.92cd6.41c 1.0896.3a142.5a6.01a9.73a1.5736.4b119.0b5.33b7.13b2.0718.8c112.7c5.10c5.36e0.40.1536.5d80.7c3.56d3.80e 0.5588.5c87.9b4.53b4.86c 1.0695.8a103.3a5.33a 7.29a 1.5664.4b89.9b4.05c6.24b 2.0575.0c85.3bc3.85cd4.27d 0.50.1497.6d71.4c3.39c3.40d 0.5524.4c80.5b3.66b4.93c 1.0619.6a86.8a4.33a5.93a1.5577.7b87.0a4.42a5.53b 2.0386.4e60.6d3.53bc2.92e

注：結(jié)果為3次重復(fù)平均值，用不同字母標(biāo)記的數(shù)字在p=0.05水平差異顯著，以a,b,c……表示不同6-BA濃度間的差異。下同。

圖2 黑果腺肋花楸無菌苗接種

表4 NAA濃度對(duì)黑果腺肋花楸生根的影響

生根培養(yǎng)基NAA濃度/(mg·L-1)鮮重/mg干重/mg株高/cm根長(zhǎng)/cm根數(shù)生根率/%0.2254.1d47.4d2.73c3.09ab3.25b 91.7e 0.4415.6b61.5c3.22b2.85bc 3.35b 97.1b 1/4MS0.6437.7a65.0a3.30b3.12a3.82a98.3a0.8416.3b63.5b3.59a3.02abc2.94c94.0c 1.0379.2c60.8c2.94c2.82c2.12d93.2d 0.2427.3b64.7c3.23c3.09b2.11d100.0a0.4443.0b79.1b 3.52b2.37d3.25b100.0a1/2MS0.6491.6a85.1a4.23a3.63a4.56a100.0a0.8397.5c60.3d 3.68b2.99b3.24b100.0a1.0385.2c57.2e2.94d2.82c2.95c100.0a0.2459.6d73.1c3.94b2.47d 2.16d100.0a0.4513.1bc74.6c4.02b2.53cd 3.13c100.0a3/4MS0.6596.8a89.3a 4.48a3.23a3.84a100.0a0.8529.6b80.7b3.56c3.02b3.33b96.5b 1.0497.7c69.2d3.48c2.57c2.21d92.3c0.2612.4d95.3e4.47c 2.63b2.82c87.4c 0.4703.9bc107.4c4.96b2.95a3.44a88.7c MS0.6734.0a119.2a5.31a3.09a2.96b92.5a0.8716.0b111.7b5.12ab2.49bc 3.06b90.5b 1.0690.3c102.9d4.51c2.39c3.03b85.2d

2.1.2NAA不同濃度配比對(duì)黑果腺肋花楸增殖的影響

設(shè)定6-BA濃度為1.0 mg·L-1的基礎(chǔ)上，選用NAA不同濃度配比。如表3所示，隨NAA濃度的增加，增殖系數(shù)為增加趨勢(shì)，于NAA濃度為0.3 mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最大值，為9.73，顯著高于其他處理，且植株鮮重為896.3 mg，干重為142.5 mg，株高為6.01 cm，植株生長(zhǎng)旺盛，葉片舒展，顯著高于其他處理。NAA濃度繼續(xù)增加，為0.4 mg·L-1時(shí)，愈傷組織出現(xiàn)于植株近根部，植株長(zhǎng)勢(shì)較弱，且增殖系數(shù)下降為7.29。NAA濃度增加至0.5 mg·L-1時(shí)，莖基部愈傷組織呈堅(jiān)硬的片狀，增殖系數(shù)也降低至5.93。因而適宜黑果腺肋花楸增殖生長(zhǎng)的NAA濃度為0.3 mg·L-1?？傮w來說，0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA的激素濃度配比更有利于黑果腺肋花楸的增殖生長(zhǎng)。

表3 NAA濃度對(duì)黑果腺肋花楸增殖的影響

激素NAA濃度/(mg·L-1)鮮重/mg干重/mg株高/cm增殖系數(shù)0.1519.5d73.8d3.93d6.16d0.2679.0b100.5b4.77b 6.93c 0.3896.3a142.5a6.01a9.73a 0.4695.8b103.3b4.53bc 7.29b 0.5619.6c86.8c4.33c 5.93e

表6 黑果腺肋花楸組培苗馴化移栽基質(zhì)篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)

處理基質(zhì)種類基質(zhì)配比鮮重/mg干重/mg株高/cm根長(zhǎng)/cm根數(shù)成活率/%A蛭石∶草炭土1∶4689.1c 105.4b 4.63c2.90c3.3c88.7cB蛭石∶草炭土2∶3738.9a 119.8a5.24a3.17b3.6b98.2aC蛭石∶草炭土3∶2713.9b110.0b5.06b3.36a3.8a93.3bD蛭石∶草炭土4∶1614.2d95.3c4.20d2.37d3.0d72.8d

圖3 黑果腺肋花楸芽的增殖生長(zhǎng)

圖4 黑果腺肋花楸的生根

2.2 黑果腺肋花楸組培苗生根培養(yǎng)基的篩選

2.2.1NAA濃度對(duì)黑果腺肋花楸組培苗生根的影響

在一定MS培養(yǎng)基濃度下，NAA濃度有利于黑果腺肋花楸組培苗的生根，NAA濃度為0.2～0.6 mg·L-1時(shí)，組培苗的生根率不斷提高。1/4 MS培養(yǎng)基上NAA濃度為0.6 mg·L-1時(shí)組培苗的生根率達(dá)到最大值98.3%，且顯著高于其他處理；1/2 MS、3/4 MS培養(yǎng)基的組培苗生根率均達(dá)到100%，MS培養(yǎng)基的組培苗于0.6 mg·L-1NAA濃度時(shí)的生根率為92.5%，達(dá)到最大值。NAA濃度繼續(xù)增加，為0.8～1.0 mg·L-1，1/4 MS、3/4 MS、MS培養(yǎng)基的根長(zhǎng)變短，根數(shù)減少，生根率降低。1/2 MS培養(yǎng)基的生根率隨著NAA濃度的增加，仍為100%，未呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但在NAA濃度為0.6 mg·L-1時(shí)，組培苗的鮮重、干重、株高、根長(zhǎng)、根數(shù)均顯著高于其他處理，植株生長(zhǎng)健壯，葉片舒展，根系完整。因而NAA濃度為0.6 mg·L-1最有利于組培苗根部的生長(zhǎng)。

2.2.2MS培養(yǎng)基濃度對(duì)黑果腺肋花楸組培苗生根的影響

從表5可以看出，MS培養(yǎng)基濃度對(duì)黑果腺肋花楸組培苗生根具有一定的影響。隨著MS培養(yǎng)基濃度的增加，組培苗的鮮重、干重、株高呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，于MS培養(yǎng)基達(dá)到最高值，顯著高于其他處理，且各處理間達(dá)到顯著差異水平。但1/4 MS、1/2 MS、3/4 MS培養(yǎng)基的組培苗生根率分別為98.3%、100%、100%，顯著高于MS培養(yǎng)基。且1/2 MS培養(yǎng)基的組培苗的根長(zhǎng)、根數(shù)顯著高于其他處理。因而綜合考慮各因素，1/2 MS培養(yǎng)基更適合黑果腺肋花楸組培苗的生根培養(yǎng)。

表5 MS培養(yǎng)基濃度對(duì)黑果腺肋花楸生根的影響

生根培養(yǎng)基鮮重/mg干重/mg株高/cm根長(zhǎng)/cm根數(shù)生根率/%1/4437.7d65.0d3.30d3.12c3.82b98.3a1/2491.6c85.1c4.23c3.63a4.56a100.0a3/4596.8b89.3b4.48b3.23b3.84b100.0aMS734.0a119.2a5.31a3.09c2.96c92.5b

2.3 移栽基質(zhì)對(duì)黑果腺肋花楸組培苗馴化的影響

如表6所示，將組培苗移栽于黑色育苗盤馴化30 d后，處理D基質(zhì)配比的成活率僅為72.8%，顯著低于其他處理。處理B、C基質(zhì)配比的成活率分別為98.2%、93.3%，而處理A的成活率為88.7%，略低于處理B、C。在A、B、C 3處理基質(zhì)配比的移栽苗，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，葉片平展，呈嫩綠色，根系較發(fā)達(dá)，綜合比較各指標(biāo)，黑果腺肋花楸最適宜的組培苗移栽基質(zhì)為處理B蛭石∶草炭土=2∶3。

3 討論與結(jié)論

通過研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑果腺肋花楸增殖生長(zhǎng)、不定根誘導(dǎo)的影響，以及基質(zhì)配比對(duì)練苗移栽的影響，結(jié)果表明：

1) 培養(yǎng)基0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA的激素濃度配比有利于黑果腺肋花楸的增殖生長(zhǎng)，最高增殖系數(shù)達(dá)9.73。與張春雨等[10]、陸爽等[11]認(rèn)為NAA與BA結(jié)合可誘導(dǎo)出黑果腺肋花楸致密的綠色愈傷組織結(jié)論相一致，但最佳的NAA與BA配比濃度未得出結(jié)論。研究表明，細(xì)胞分裂素濃度不是越高越好，濃度過高反而使玻璃化程度加重，成苗率降低[12-13]，通過本試驗(yàn)也得到驗(yàn)證，但所采用的激素濃度有所不同，可能與所選取的外植體不同有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

圖5 黑果腺肋花楸組培苗的馴化

2) MS培養(yǎng)基中降低礦物質(zhì)濃度有利于組培苗的生根[11,14]。黑果腺肋花楸繼代苗的生根培養(yǎng)以1/2 MS+0.6 mg·L-1NAA為最佳，最高生根率達(dá)到100%。而馬冬菁、陸爽等研究[11,15]分別認(rèn)為1/2 MS+6.0 mg·L-1ABT、1/2 MS+6.0 mg·L-1IBA為最佳生根培養(yǎng)基，不同激素的誘導(dǎo)作用有待于進(jìn)一步研究。

3) 組培苗的馴化移植，即植株由異養(yǎng)向自養(yǎng)轉(zhuǎn)化的過程，是組培成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為提高黑果腺肋花楸組培苗的成活率，試驗(yàn)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行了篩選?；|(zhì)B蛭石∶草炭土=2∶3移栽的組培苗長(zhǎng)勢(shì)良好，在鮮重、干重、株高、成活率各方面均顯著高于其他基質(zhì)配比，其根長(zhǎng)、根數(shù)僅次于處理C蛭石∶草炭土=3∶2，可能與蛭石含量高，基質(zhì)疏松，孔隙度大，有利于根系的生長(zhǎng)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。綜合各指標(biāo)，黑果腺肋花楸最適宜的組培苗移栽基質(zhì)為處理B蛭石∶草炭土=2∶3。

黑果腺肋花楸的樹型美觀、葉色多變、果實(shí)宿存，四季可賞，是園林景觀的優(yōu)良樹種。且其果即可食用，又具有很高的藥用價(jià)值，應(yīng)用前景廣泛。利用組培方式進(jìn)行繁育不受季節(jié)、時(shí)間和環(huán)境的限制，可快速提高繁殖系數(shù)，縮短植株生長(zhǎng)年限，有利于解決黑果腺肋花楸苗木市場(chǎng)短缺的現(xiàn)象，也為規(guī)?；a(chǎn)提供了一定的參考依據(jù)。