微藻育種研究進(jìn)展

范 勇， 胡光榮， 王麗娟， 李福利

(中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所， 青島 266001)

微藻育種研究進(jìn)展

范 勇， 胡光榮， 王麗娟， 李福利

(中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所， 青島 266001)

微藻是一種單細(xì)胞光合自養(yǎng)生物，作為初級(jí)生產(chǎn)者，在自然界中廣泛存在。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，微藻已經(jīng)應(yīng)用于食品藥品、可再生能源生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面。為了得到性狀更為優(yōu)良的藻種，針對(duì)微藻育種的相關(guān)技術(shù)也在加速發(fā)展。微藻育種主要包括種質(zhì)獲取和表型檢測(cè)兩個(gè)方面，通過(guò)3種途徑：自然選育，誘變育種和基因工程育種。隨著產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)的需要，多種先進(jìn)的育種手段引入微藻育種中，包含CRISPR在內(nèi)的多種基因編輯手段也逐步在微藻中進(jìn)行了嘗試?；谖⒃骞夂舷到y(tǒng)，天然產(chǎn)物光譜和熒光標(biāo)記等高通量篩選手段也幫助微藻育種的進(jìn)一步發(fā)展。對(duì)上述微藻育種方案和技術(shù)路線進(jìn)行綜述，并對(duì)今后微藻育種的方向進(jìn)行探討。

微藻產(chǎn)業(yè)化；誘變育種；高通量篩選；光譜學(xué)分析

微藻是地球上最初級(jí)的生產(chǎn)者，能夠進(jìn)行光合作用釋放氧氣，在細(xì)胞形態(tài)上主要是單細(xì)胞或者簡(jiǎn)單的多細(xì)胞形式，在進(jìn)化上包含有原核的藍(lán)藻細(xì)胞，也有真核的綠藻，硅藻等。地球上約有5萬(wàn)種微藻種類[1]，其分布廣泛，生活環(huán)境多種多樣，隨著漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程，微藻具有多樣的形態(tài)和生理活性，甚至在一些極端環(huán)境中也有微藻的存在。因此，微藻資源是巨大的資源寶庫(kù)，隨著對(duì)微藻研究的逐步發(fā)展，微藻在各個(gè)領(lǐng)域均展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[2]。例如，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域微藻是重要的水產(chǎn)餌料和蛋白飼料[3]。多數(shù)微藻含有多糖、多不飽和脂肪酸、色素等生物活性成分，這些是目前天然保健食品的來(lái)源[4]。在逆境條件下，微藻可以積累中性脂，因此可以作為生物液體燃料的原料，在近幾十年掀起了微藻生物能源研究開(kāi)發(fā)的熱潮[5]。微藻在水處理和生態(tài)修復(fù)方面也有著強(qiáng)大的功能[6-7]。另外以藍(lán)藻為底盤(pán)生物可以設(shè)計(jì)合成“細(xì)胞工廠”，進(jìn)行大宗化學(xué)品的合成，也取得了顯著的進(jìn)展[8]。微藻的生長(zhǎng)速度快，不需要占用耕地，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化管理，因此，微藻產(chǎn)業(yè)化的潛力巨大，前景廣闊。但是，目前以微藻作為產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，還存在諸多挑戰(zhàn)，微藻作為農(nóng)產(chǎn)品沒(méi)有享受農(nóng)業(yè)的政策；作為工業(yè)產(chǎn)品沒(méi)有形成規(guī)模效應(yīng)；作為保健食品，目前品種單一且市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)無(wú)序；作為生物能源其產(chǎn)量不足；作為動(dòng)物飼料和水產(chǎn)活體餌料目前生產(chǎn)和配送成本過(guò)高(圖1)。為了解決上述問(wèn)題，在微藻產(chǎn)業(yè)培育的戰(zhàn)略層面需要加強(qiáng)重視，期待國(guó)家出臺(tái)對(duì)微藻產(chǎn)業(yè)的扶持政策，在基礎(chǔ)研究方面，加強(qiáng)微藻藻種的育種工作技術(shù)創(chuàng)新。

圖1 微藻產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀與技術(shù)挑戰(zhàn)

目前的微藻育種主要集中在兩個(gè)方面，一個(gè)是種質(zhì)獲取手段，一個(gè)是表型檢測(cè)手段。種質(zhì)獲取手段：一方面在自然界中篩選以及通過(guò)代謝進(jìn)化獲得；另一方面，通過(guò)日益先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)微藻進(jìn)行誘變，在優(yōu)良藻種的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升。另外，隨著基因工程突飛猛進(jìn)的發(fā)展，在微藻中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳改造也在逐步地實(shí)現(xiàn)中[9-10]。表型檢測(cè)手段：傳統(tǒng)的檢測(cè)手段不斷地被先進(jìn)穩(wěn)定的儀器代替，例如，利用拉曼光譜、紅外光譜和流式細(xì)胞技術(shù)等檢測(cè)多種微藻中的目標(biāo)代謝物。微流控技術(shù)近年來(lái)也被引入微藻細(xì)胞的分析和分選方法中來(lái)，大大提高了分析的精度[11-13]。另外，隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展，從組學(xué)的數(shù)據(jù)發(fā)掘中能更有針對(duì)性地發(fā)現(xiàn)和鑒定突變，從而進(jìn)一步揭示突變性狀在分子水平的表達(dá)機(jī)理，為今后的遺傳改造提供理論基礎(chǔ)。

圖2 微藻育種的研究方向

1 種質(zhì)獲取手段

自然界中微藻的獲取主要來(lái)自不同環(huán)境中的藻種采集、分離、馴化。自然選擇育種的育種周期長(zhǎng)，且不確定性較大。但是在自然界篩選到的藻株，結(jié)合采樣當(dāng)?shù)氐牡乩砗蜌夂颦h(huán)境等因素，在進(jìn)化和物質(zhì)代謝方面具有較高的研究?jī)r(jià)值。在應(yīng)用到生產(chǎn)的過(guò)程中，其產(chǎn)品在應(yīng)用和推廣過(guò)程中較容易被社會(huì)認(rèn)可。目前，對(duì)自然界中進(jìn)行的微藻篩選主要是對(duì)環(huán)境脅迫下具有頑強(qiáng)和特殊生存能力的微藻進(jìn)行分析，在這個(gè)過(guò)程中常常也會(huì)發(fā)現(xiàn)具有高附加值產(chǎn)物的株系。Yuan等通過(guò)分析中國(guó)山東等地的微藻油脂情況，發(fā)現(xiàn)了一株微藻MychonastesaferHSO-3-1的脂肪酸組成中，神經(jīng)酸含量明顯高于已知的其他已知微藻的神經(jīng)酸含量[14]。由于神經(jīng)酸是一種具有高附加值的長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸(very long chain monounsaturated fatty acid， VLMFA)，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣泛，因此該藻獲得了研究人員的重視，作為富含高附加值產(chǎn)品的產(chǎn)油微藻投入產(chǎn)業(yè)化的開(kāi)發(fā)。

實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，其核心在于大規(guī)模、高效、低成本培養(yǎng)微藻以獲得大量的生物質(zhì)。目前，微藻的開(kāi)發(fā)主要集中在單細(xì)胞微藻，但在室外規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，由于敵害生物(主要是原生動(dòng)物)對(duì)這些尺寸細(xì)小的單細(xì)胞微藻(通常直徑在1～10 μm)的攝食常導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，而且單細(xì)胞微藻的采收困難且成本較高，因此，獲得高產(chǎn)、易采收、抗污染能力強(qiáng)等具工業(yè)應(yīng)用性狀的藻種是微藻生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。針對(duì)上述問(wèn)題，汪輝等將藻種選育轉(zhuǎn)移到以前未受關(guān)注的絲狀微藻上[15]，對(duì)國(guó)內(nèi)外多株絲狀微藻的性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，獲得了一株高含油的淡水黃絲藻(Tribonema)，其絲狀體長(zhǎng)達(dá)0.5～3 μm，利用40 L平板反應(yīng)器培養(yǎng)21 d，細(xì)胞干重3.14 g/L、總脂含量為50.23%，其中中性脂(TAG)占總脂的80%。在不需要添加任何絮凝劑情況下，氣浮法采收率達(dá)95.57%。同時(shí)，由于該藻絲體長(zhǎng)，在室外經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的規(guī)?；囵B(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)害現(xiàn)象，顯示其良好的抗蟲(chóng)害特性。目前絲狀微藻的規(guī)?；a(chǎn)特性漸漸被人們重視，隨后發(fā)現(xiàn)在絲狀微藻Tribonemaminus中含有特殊ω-7不飽和脂肪酸，棕櫚油酸(Palmitoleic acid，C16:1Δ9)[16]，因此絲狀微藻在易培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)下，還具有高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)潛力，除此之外，絲狀微藻還可以合成多種色素，如角黃素(canthaxanthin)、蝦青素(astaxanthin)等。基于以上特點(diǎn)，絲狀微藻選育將是微藻產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的重要機(jī)遇。在目前的微藻育種中，從自然界中篩選微藻的方案雖然工作繁雜、難度較大，但是在自然環(huán)境還未被人類完全了解的今天，在自然界中不斷地發(fā)掘和篩選藻種對(duì)開(kāi)發(fā)新的藻種資源和研究藻類的進(jìn)化具有重要的意義。

誘變育種是當(dāng)前最主要的藻種獲取手段，通過(guò)化學(xué)誘變以及物理誘變的方法對(duì)藻種的遺傳過(guò)程進(jìn)行干擾，造成藻種遺傳信息的改變，在大樣本量的群體中，通過(guò)快速的篩選手段得到需要的優(yōu)良性狀，這個(gè)過(guò)程隨著篩選手段的不斷豐富，逐漸成為主要的育種方案。誘變育種主要包括物理誘變和化學(xué)誘變兩種形式，物理因素如各種射線、微波或激光等處理誘變材料，習(xí)慣上稱之為輻射育種；化學(xué)因素是運(yùn)用能導(dǎo)致遺傳物質(zhì)改變的一些誘變劑對(duì)樣品進(jìn)行處理。物理誘變劑主要有紫外線、X-射線、γ-射線、快中子、激光、微波、離子束等?；瘜W(xué)誘變劑主要有烷化劑、天然堿基類似物、氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。國(guó)內(nèi)外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道在微藻中使用誘變育種的方法提高了微藻的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。成本較低的類似于紫外輻照，甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)和N-甲基-N-硝基-亞硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine，NTG)等，在多種微藻中(Phaeodactylumtricornutum,Pavlovalutheri,Nannochloropsisoculata,Haematococcuspluvialis,Schizochytriumsp.,Chlorellasorokiana,Scenedesmusobliquus,Isochrysisgalbana,Dunaliellasalina) 進(jìn)行了誘變實(shí)驗(yàn)并獲得很多優(yōu)良的株系[17-24]。韓國(guó)研究人員使用不同劑量的伽馬射線輻照不同微藻，獲取淀粉和油脂含量突變的藻株[25-26]，其中油脂含量提高了1.4倍。近年來(lái)重離子輻照(Heavy-ion irradiation)，常壓室溫等離子體(Atmospheric room temperature plasma，ARTP)輻照技術(shù)也逐步應(yīng)用于微藻的突變株獲得，Ma等[27]利用重離子輻照對(duì)Nannochloropsis進(jìn)行輻照，突變株的油脂含量較野生型提高了28%；Hu等[28]通過(guò)重離子輻照對(duì)Desmodesmussp.進(jìn)行輻照，也獲得了較野生型油脂含量顯著提高的突變株系[28]，Liu等[29]利用低溫等離子對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘變處理，并通過(guò)劑量、放電時(shí)間等參數(shù)的優(yōu)化，獲得了諸多高產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻突變株，其中最高單位蝦青素產(chǎn)量是誘導(dǎo)前出發(fā)藻株近2倍[29]。各種突變手段在使用過(guò)程中各有特點(diǎn)，在一定的劑量和突變篩選方法配合下都可以篩選到陽(yáng)性突變的株系。不同突變方法在選擇上主要偏重的誘變方式需要具有對(duì)誘變物種的廣譜性，誘變操作技術(shù)簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境污染較小，對(duì)操作人員的安全有較高的保障。但誘變育種的方法對(duì)一些新的優(yōu)良性狀的發(fā)現(xiàn)存在盲區(qū)。對(duì)突變機(jī)理的不明確以及表型性狀存在不穩(wěn)定也會(huì)對(duì)生產(chǎn)造成一定的影響。

基因工程育種方法是目前很多課題組積極展開(kāi)研究的方向(表1)，目前在C.reinhardtii，P.tricornutum[30]，C.kessleri[31]，Nannochloropsis[32]和D.salina[33]中實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)，能夠進(jìn)行基因的沉默和敲除，對(duì)微藻進(jìn)行基因工程的改造，需要對(duì)選擇標(biāo)記、載體以及轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行更多的嘗試?；蚬こ淘逯昃哂休^高的穩(wěn)定性，且能夠通過(guò)定向的改造獲得較理想的突變株。在最新的報(bào)道中，使用CRISPR/Cas9這種由RNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯的技術(shù)已開(kāi)始在微藻中實(shí)現(xiàn)精確的基因改造[34-35]，Wang等[36]通過(guò)特定外源Cas9蛋白和指引RNA分子(guide RNA)的設(shè)計(jì)和共同表達(dá)，結(jié)合基于二代測(cè)序的高通量轉(zhuǎn)化株鑒定方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Nannochloropsis硝酸還原酶基因序列上5個(gè)堿基的精確刪除，并篩選分離出與預(yù)測(cè)的表型和基因型均完全契合的基因組編輯突變?cè)逯辏谖⒃逯惺痉读嘶蚪M的精準(zhǔn)編輯。這一基因組編輯技術(shù)的建立，使得對(duì)Nannochloropsis基因組上每個(gè)編碼或非編碼位點(diǎn)的功能鑒定成為可能。將來(lái)微藻轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的豐富會(huì)有助于微藻遺傳改造策略的建立。另外一些針對(duì)植物和微藻的生物信息學(xué)平臺(tái)也在逐步發(fā)展，例如 Algal Functional Annotation Tool[37]，GreenCut2[38]，AlgaGEM[39]，Bag2D[40]和PredAlgo[41]，這些平臺(tái)在多種微藻的基因組水平上進(jìn)行了大量的基因和蛋白功能的注釋，為今后的微藻遺傳改造提供了分析的基礎(chǔ)。目前，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行的微藻育種在方法上已逐步成熟，但應(yīng)用的微藻種類仍然有限，在許多微藻中尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。隨著遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，以及基因組測(cè)序費(fèi)用的進(jìn)一步降低，不同微藻數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富，微藻的基因工程育種將是一個(gè)有巨大的發(fā)展前景的方向。

2 表型檢測(cè)手段

傳統(tǒng)的表型檢測(cè)手段一般主要包括對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速率及耐受溫度范圍的描述，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的油脂、蛋白及生物活性成分主要通過(guò)物理壓榨，有機(jī)溶劑萃取等方法提取后進(jìn)行分析。有機(jī)溶劑提取過(guò)程會(huì)用到不同熔點(diǎn)的有機(jī)溶劑進(jìn)行分離，在高溫下會(huì)對(duì)一些藻類活性物質(zhì)產(chǎn)生影響，而且最終降低活性物質(zhì)的得率。

常規(guī)微藻生理信息指標(biāo)的檢測(cè)耗時(shí)費(fèi)力，無(wú)法滿足快速和高通量的信息獲取需要。當(dāng)前在實(shí)際過(guò)程分析中仍多使用操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的離線化學(xué)分析或色譜分析方法。近年來(lái)，光學(xué)傳感器被越來(lái)越多地應(yīng)用于生物制品的品質(zhì)信息獲取,其中紅外光譜、拉曼光譜和核磁共振譜是最主要的3大無(wú)損分析技術(shù)。紅外光譜分析(Infrared Spectra Analysis)是介于可見(jiàn)光和中紅外之間的電磁輻射波，近紅外光譜區(qū)與有機(jī)分子中含氫基團(tuán)(O-H, C-H, N-H)振動(dòng)的合頻和各級(jí)倍頻的吸收區(qū)一致。通過(guò)掃描樣品的近紅外光譜,得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息，并且采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可以對(duì)樣品進(jìn)行定性和(或)定量分析測(cè)定。目前在微藻的研究方面已有多個(gè)方向的應(yīng)用，朱紅艷等利用浸入式可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)對(duì)普通小球藻、蛋白核小球藻、微綠球藻、萊茵衣藻進(jìn)行藻種鑒別，為藻種分類研究提供了新思路[51]。Hirschmugl等采用了傅里葉變換紅外光譜技術(shù)來(lái)研究藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其營(yíng)養(yǎng)狀況。這種方法無(wú)需對(duì)樣品或者很少需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理就可以提供藻類的生化細(xì)胞組成和營(yíng)養(yǎng)狀況[52]。近年來(lái)，利用紅外光譜技術(shù)鑒別微藻中代謝物結(jié)構(gòu)的研究越來(lái)越普遍。傅里葉變換紅外光譜技術(shù)在分析藻類多糖的主要單糖組成、環(huán)狀結(jié)構(gòu)、半縮醛羥基構(gòu)型及取代基類型方面效果顯著[53]。薛松等[54]利用FTIR(Fourier transform infrared spectroscopy)對(duì)微藻生物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以蛋白質(zhì)酰胺I譜帶作為內(nèi)參比峰，計(jì)算油脂及多糖的相對(duì)含量。該方法實(shí)現(xiàn)了快速同時(shí)測(cè)定微藻細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)及多糖的相對(duì)含量。在微藻總脂含量測(cè)定方面，張敬建等[55]以斜生珊藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)該藻的細(xì)胞內(nèi)油脂含量進(jìn)行定量，并且與尼羅紅熒光光譜法進(jìn)行對(duì)比，為大規(guī)模篩選高油藻株及油脂積累過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。

表1 具有代表性的產(chǎn)業(yè)化微藻產(chǎn)品、微藻培養(yǎng)方式及基因工程方法介紹

#CRISPR/Cas：成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/核酸酶系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)；TALEN：轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nuclease)；ZFN：鋅指核酸酶技術(shù)(zinc finger nuclease)

核磁共振(Nuclear magnetic resource, NMR)是一種通過(guò)檢測(cè)原子核磁性的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。NMR的檢測(cè)原理是通過(guò)在磁性原子核吸收外加磁場(chǎng)中的射頻脈沖然后產(chǎn)生相鄰能級(jí)的躍遷,形成共振。技術(shù)早在20世紀(jì)70年代就已經(jīng)開(kāi)始用于食品科學(xué)研究。由于具有無(wú)損、高效、快速、樣品需求少和譜峰重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),因此越來(lái)越受到人們的關(guān)注。Guo等[56]利用時(shí)域核磁共振(Time-domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR)的方法對(duì)微藻的油脂含量進(jìn)行分析，比較了尼羅紅染色方法檢測(cè)油脂含量的準(zhǔn)確度，使用TD-NMR的回歸曲線R2=0.9973，遠(yuǎn)好于使用尼羅紅染色的準(zhǔn)確度(R2=0.9067)，并且該方法可以做到對(duì)細(xì)胞的無(wú)損分析。Wang等[57]使用低場(chǎng)核磁共振(Low-filed NMR)建立了一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)小球藻體內(nèi)油脂含量的方法。最低檢出限為0.002602 g(藻粉中)和0.3202 g/L(藻液中)。在1.12～8.97 g/L濃度范圍的油水混合液中，具有較高的檢測(cè)準(zhǔn)確度(R2>0.99)。此外，該方法成功地用于在線監(jiān)測(cè)微藻在異養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程中脂質(zhì)積累的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

拉曼光譜的產(chǎn)生原理是當(dāng)單色光束的入射光子與分子相互作用時(shí)會(huì)產(chǎn)生非彈性碰撞。碰撞過(guò)程中光子改變運(yùn)行方向,同時(shí)分子和光子之間發(fā)生能量交換,使得光子頻率發(fā)生改變,從而發(fā)生拉曼散射。拉曼光譜從信號(hào)的角度和紅外光譜是互補(bǔ)的。這是因?yàn)槔庾V是散射光譜，反映的是分子極化率變化,而紅外光譜是吸收光譜,反映的是分子偶極距的變化。邵永妮等[58]利用激光共聚焦顯微拉曼技術(shù)對(duì)2種不同藻種進(jìn)行了鑒別研究，結(jié)果表明，激光共聚焦顯微拉曼技術(shù)可以快速準(zhǔn)確的將兩個(gè)藻種鑒別出來(lái)；Collins等[59]利用共聚焦顯微拉曼技術(shù)，研究了類胡蘿卜素在雨生紅球藻中的分布，同時(shí)研究也顯示出拉曼顯微技術(shù)在研究微藻細(xì)胞體內(nèi)色素變化中的巨大價(jià)值。在微藻油脂的研究方面，Wu等[60]通過(guò)對(duì)4種藻14個(gè)克隆類型的共振拉曼光譜的差異進(jìn)行分析，研究了微藻體內(nèi)油脂含量的不飽和度；Samek等[61]通過(guò)拉曼光譜對(duì)Trachydiscusminutes，Chlamydomonassp.，Botryococcussudeticus3種微藻藻種的油脂不飽度進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜技術(shù)得出的結(jié)果可以很好地與氣相色譜結(jié)果相匹配，從而證明了拉曼光譜技術(shù)在微藻油脂檢測(cè)方面的準(zhǔn)確性?？偠灾?，利用光譜信息在微藻的表型檢測(cè)手段方面已經(jīng)進(jìn)行了較多研究，光學(xué)傳感器檢測(cè)技術(shù)具有方便、快速、高效、準(zhǔn)確、無(wú)需破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。目前的劣勢(shì)主要是儀器維護(hù)費(fèi)用較高，樣品對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)較匱乏。

針對(duì)微藻和植物，光譜方法還包含植物的光合系統(tǒng)的光譜信號(hào)。在藻類培養(yǎng)過(guò)程中，藻類的光合作用效率與二氧化碳濃度、光照強(qiáng)度、溫度、營(yíng)養(yǎng)元素等有密切關(guān)系，在培養(yǎng)過(guò)程中，檢測(cè)其光合作用效率是一個(gè)極其重要的指標(biāo)；在藻類的選育過(guò)程中，相同條件下光合效率的高低關(guān)系到微藻生長(zhǎng)速率和生物質(zhì)產(chǎn)量，是重要的篩選指標(biāo)。

藻類葉綠素分子所吸收的光能有3種去處：1)驅(qū)動(dòng)光合作用(光化學(xué))；2)以光的形式重新散發(fā)，即葉綠素?zé)晒猓?)以熱的形式耗散。其中，只有葉綠素?zé)晒馐强梢灾苯訖z測(cè)到的數(shù)據(jù)，根據(jù)葉綠素?zé)晒獾漠a(chǎn)量，可以間接計(jì)算出微藻的光化學(xué)效率和熱耗散。雖然葉綠素?zé)晒庵徽计湮展獾?%～2%，但很容易被檢測(cè)。使用特定波長(zhǎng)的光譜照射微藻細(xì)胞，然后在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)范圍內(nèi)可以檢測(cè)到葉綠素?zé)晒獾募ぐl(fā)，實(shí)現(xiàn)對(duì)葉綠素?zé)晒獾亩糠治鯷62]。葉綠素?zé)晒夥治隹梢愿嬖V我們關(guān)于光合系統(tǒng)II(Photosynthetic system II，PSII)的信息，通過(guò)PSII的電子流向?qū)嶋H上反映了光合作用的整體速率，PSII也是光合系統(tǒng)中最容易受到光損傷的部位，對(duì)PSII的損傷是微藻細(xì)胞受到脅迫的第一個(gè)表現(xiàn)，Hu等[28]利用葉綠色熒光儀(Imaging-PAM)對(duì)誘變后的微藻進(jìn)行高通量的篩選，基于最大光量子效率(Fv/Fm)對(duì)藻細(xì)胞在相同脅迫條件下進(jìn)行篩選，篩選得到的突變株，其油脂產(chǎn)量同野生型比較顯著提高。因此PSII的效率可以作為微藻高通量篩選高活性突變株的標(biāo)準(zhǔn)之一[28]。因此，葉綠素?zé)晒獍S富的光合作用信息，是快速、靈敏和無(wú)損傷的研究和測(cè)定逆境對(duì)植物光合作用的理想方法。

3 展望

以微藻為載體的產(chǎn)業(yè)鏈在國(guó)內(nèi)正處在一個(gè)快速起步的階段，隨著社會(huì)上對(duì)螺旋藻、雨生紅球藻蝦青素、小球藻蛋白等微藻產(chǎn)品的逐步認(rèn)可，各種微藻的研究和培養(yǎng)規(guī)模將會(huì)不斷擴(kuò)大。因此，在近10年內(nèi)，在微藻育種領(lǐng)域，有無(wú)限的機(jī)遇等待著去發(fā)掘。目前，確定標(biāo)準(zhǔn)化的微藻育種評(píng)價(jià)手段和評(píng)價(jià)機(jī)制是近期需要藻類科研工作者思考的重要議題。將各種育種方法結(jié)合使用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，會(huì)更有利于微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在微藻育種方面，吳迪等[63]提出了“數(shù)字微藻”的概念，該概念采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)微藻選育和生產(chǎn)全過(guò)程進(jìn)行數(shù)字化信息獲取、控制、管理和決策，其中微藻育種信息的快速準(zhǔn)確獲取是實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)與管理的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。與此相關(guān)的研究工作才剛剛起步，相信未來(lái)在微藻育種、養(yǎng)殖、收獲和產(chǎn)品加工銷售等環(huán)節(jié)，微藻數(shù)字信息快速獲取將得到快速的發(fā)展。另外，在育種的同時(shí)，推廣通用的中試驗(yàn)證平臺(tái)，建立合理的評(píng)價(jià)平臺(tái)，以及后期基于基因組測(cè)序以及DNA Barcoding技術(shù)，建立微藻藻種的專利保藏流程和藻種追溯鑒定技術(shù)，都是對(duì)微藻育種學(xué)科發(fā)展的重要保護(hù)，對(duì)微藻產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展具有一定的保障作用。

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Research progress on microalgae breeding

FAN Yong， HU Guang-rong， WANG Li-juan， LI Fu-li

(Key Laboratory of Biofuels, Chinese Acadeing of Sciences, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Aeademy of Sciences(QIBEBT-CAS), Qingdao 266001, China)

Microalgae is a unicellular photosynthetic autotrophic organism that widely distributes in nature as a primary producer. For half a century, microalgae has been used in food and medicine, renewable energy production, environmental protection and so on. In order to improve productivity or robustness, microalgae breeding technology has been developed significantly. The breeding of microalgae mainly includes two aspects: mutant acquisition and phenotypic detection. The mutants can be obtained through three ways: natural breeding, mutation breeding, and genetic engineering breeding. A variety of advanced breeding methods, including gene editing method CRISPR, have been gradually adopted in microalgae. High-throughput screening based on microalgae photosynthetic system, natural product spectra, and fluorescent labelling greatly facilitate the development of microalgae breeding. In this paper, microalgae breeding technologies are reviewed, and the future direction of microalgae breeding is discussed.

microalgae industrialization; mutation breeding; high throughput screening; spectroscopic analysis

2016-10-08；

2017-02-20

國(guó)家自然科學(xué)基金—大科學(xué)裝置聯(lián)合基金(U1232126)；國(guó)家自然基金—青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31602154)；國(guó)家高科技研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃，2014AA022003)

范 勇，助理研究員，研究方向?yàn)槲⒃迳砩?，E-mail：fanyong@qibebt.ac.cn

李福利，研究員，研究方向?yàn)槲⑸锷砩?，E-mail：lifil@qibebt.ac.cn

S968.4；Q949.2

A

2095-1736(2017)02-0003-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.003