金蓮花種子發(fā)芽的條件因素及組織培養(yǎng)研究

劉曉光， 顧翰琦 ， 單梅華， 張 帆， 李 焱， 徐宵月， 董建新

(河北民族師范學院生物與食品科學系， 河北 承德 067000)

金蓮花(TrolliuschinensisBunge)又稱旱荷、旱金蓮、陸地蓮等，為毛茛科金蓮花屬一年生或多年生草本植物，多生長在海拔1 800 m以上的高山草甸或疏林地帶[1]。金蓮花在中國分布較廣泛，但尤以河北塞罕壩地區(qū)所產(chǎn)為佳品，是優(yōu)良的園藝花卉植物[2-4]。金蓮花花朵有極高的藥用價值，可抗菌消炎[5]、治療咽炎及上呼吸道感染[6]等，其黃酮具有較好的抗氧化作用[7]，其藥渣可進行發(fā)酵生產(chǎn)高蛋白發(fā)酵物[8]。嚴力群研究顯示，金蓮花莖葉中黃酮含量與花朵中的含量基本持平[9]。對金蓮花的掠奪性采摘，加上塞罕壩景區(qū)旅游人群的增多，金蓮花的生境遭到嚴重破壞。近年來，圍場連年干旱也嚴重影響了金蓮花的生長和繁殖，諸多原因?qū)е陆鹕徎〝?shù)量以每年10%的速度急劇下降[10]。因此，金蓮花的資源保護成為需要迫切解決的問題。近年來，有關(guān)金蓮花的研究大多集中于金蓮花藥理成分、醫(yī)藥制劑等方面[11-15]；而有關(guān)其育種，繁殖的研究較少。部分研究者[4,16]采用野生撫育的方式進行繁殖，但撫育需要大量的土地和時間，并且存在存活率低，生長速度慢等問題，仍無法滿足市場所需。而利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段進行的研究較少，但滅菌方面存在較大問題，導致污染嚴重，繁殖系數(shù)低[17]，鄭志新[18]等對金蓮花快速繁殖體系進行了優(yōu)化，但仍存在增長速率慢，幼苗畸形，褐化等問題。因此對于金蓮花發(fā)育遲緩、無菌苗生長緩慢、繼代不穩(wěn)定等問題成為當前重要的研究工作[17]。金蓮花大多采用種子繁殖，但由于其種子本身存在休眠特性造成萌發(fā)率低，而對此方面的研究[17-22]結(jié)果差異較大。鑒于金蓮花的價值高且種子昂貴，即使種子貯藏時間較長也應加以利用。本研究以貯藏2年的金蓮花種子為材料，摸索適合其發(fā)芽的條件、培養(yǎng)基激素配比以及適宜基質(zhì)種類，旨在為其種質(zhì)保育和擴大繁殖栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

金蓮花種子取自承德市塞罕壩，在室溫下保存2年。

1.2試驗方法

1.2.1非離體條件下不同因素對金蓮花種子萌發(fā)及生長的影響

1) 不同濃度GA3對金蓮花種子萌發(fā)的影響。

種子用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用升汞浸種10 min，無菌水沖洗3次之后，將金蓮花種子用濃度分別為200，300，400，500，700，900 mg·L-1的GA3在25 ℃分別浸種2 d。以清水在25 ℃分別浸泡2 d作對照，分別放入鋪有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每個處理30粒種子，重復3次。將種子置于植物組培室，光照時間16 h·d-1，溫度為(25±1)℃。從放入培養(yǎng)皿中開始計算，以15 d為1個統(tǒng)計周期，統(tǒng)計萌發(fā)率、成苗率以及開始萌發(fā)時間。其中以胚根突破種皮為萌發(fā)標準。

2) 不同浸種時間對金蓮花種子萌發(fā)的影響。

將滅菌的金蓮花種子用上述探究出的最適GA3溶液，在25 ℃的環(huán)境下浸種，設(shè)置時間為1、2、3 d，浸種完成后將其置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。定期適量澆水，保持濕潤。每個處理30粒種子，重復3次。

3) 不同浸種溫度對金蓮花種子萌發(fā)的影響。

種子用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用升汞浸種10 min，無菌水沖洗3次之后，采用上述探究出的最適的GA3濃度及浸種時間，將種子分別在25 ℃和4 ℃條件下浸泡，浸泡完成后放入鋪有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25 ℃條件下進行發(fā)芽試驗。每個處理30粒種子，重復3次。統(tǒng)計依據(jù)同上。

4) 不同基質(zhì)對金蓮花幼苗生長的影響。

用以上試驗篩選出的最適打破種子休眠的方法，采用無菌消毒方法處理種子后，將種子置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，當胚根長1～2 mm時進行移栽，將萌發(fā)的種子以點播的方法播于裝有不同基質(zhì)的花盆中，覆土厚度5～10 mm，生長2個月后，開始記錄其成苗率，株高，葉片數(shù)量，葉片面積。其中不同基質(zhì)分別為純草炭土、混合基質(zhì)1(草炭土︰蛭石的體積比為2︰1)、混合基質(zhì)2(草炭土︰蛭石︰珍珠巖的比例為3︰2︰1)、每種基質(zhì)12株，重復3次。

1.2.2離體條件下不同激素種類及配比對金蓮花種子萌發(fā)的影響

1) 不同濃度GA3對金蓮花種子萌發(fā)的影響。

將金蓮花種子用上述方法滅菌后，采用400、800 mg·L-1的GA3分別在4 ℃條件下冷浸4 d；并以無菌水冷浸相同的時間作為對照，然后將其在無菌條件下接種于1/2 MS+1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基[17]中。以20 d為1個周期，統(tǒng)計其發(fā)芽率，成苗率以及開始萌發(fā)時間，以種子突破種皮為萌發(fā)標準。

2) 不同激素組合對金蓮花種子萌發(fā)的影響。

在超凈工作臺中，將種子用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用升汞浸種10 min，無菌水沖洗3次之后，采用上述最適處理條件對金蓮花種子進行處理，然后分別接種到含不同濃度TDZ、IBA、6-BA和NAA的培養(yǎng)基中(見表1)。以不含任何激素的組為對照，置于(25±1)℃下培養(yǎng)。以萌發(fā)率、成苗率、開始萌發(fā)時間為指標，篩選種子無菌播種最適培養(yǎng)基配方。

表1 不同激素種類及濃度配比

處理TDZ/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)ck0.00.000.0A10.10.500.0A20.20.500.0A30.10.200.0A40.20.200.0B10.00.010.5B20.00.020.5B30.00.010.2B40.00.020.2

1.3指標測定

萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

成苗率(%)=(幼苗數(shù)/萌發(fā)的種子總數(shù))×100%；

葉幅(cm2)=葉長×葉寬。

株高(cm)采用直尺測量植株高度，以土壤表面到植株最高點為株高測量標準，葉片數(shù)采用單株金蓮花所有葉片記數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件和SPSS 20.0軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1不同條件因素對金蓮花種子萌發(fā)及生長的影響

2.1.1不同濃度GA3對金蓮花種子萌發(fā)的影響

由表2可知，使用200～500 mg·L-1GA3處理金蓮花種子均可打破其休眠，但不同濃度GA3處理的效果不同。在200～900 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，金蓮花種子的萌發(fā)率、成苗率呈先增高后下降的趨勢，當濃度達到400 mg·L-1時，萌發(fā)率和成苗率達到最高，其中萌發(fā)率與其他處理差異性顯著；GA3濃度為700 mg·L-1和900 mg·L-1時，種子的萌發(fā)率低于對照，表明濃度過高對種子萌發(fā)有抑制作用。GA3濃度為400 mg·L-1時，成苗率最高，其次是300、500 mg·L-1的處理，三者之間差異不顯著，但顯著高于其他處理。從萌發(fā)時間來看，GA3濃度為200～500 mg·L-1時，可明顯縮短萌發(fā)時間，其中400 mg·L-1的處理效果最佳；而GA3濃度為700、900 mg·L-1時對縮短萌發(fā)時間的作用不明顯。綜上所述，適量的GA3浸種可提高金蓮花種子的萌發(fā)率和成苗率，并可顯著縮短其萌發(fā)時間， 使用400 mg·L-1的GA3浸種2 d效果最好。

表5 不同基質(zhì)對金蓮花幼苗生長的影響

基質(zhì) 0～60d 61～120d 株高/cm葉數(shù)/片葉幅/cm2株高/cm葉數(shù)/片葉幅/cm2純草炭土3.45±1.03a2.27±0.59a1.52±0.64a6.45±2.13b6.00±1.93a6.22±6.00a混合基質(zhì)12.41±0.52b2.07±0.46a0.99±0.22b7.31±2.12b5.87±1.89a8.29±5.97a混合基質(zhì)22.10±0.39b1.87±0.35a0.92±0.38b9.54±2.87a5.53±1.60a8.39±2.84a

注：從上左起至下右設(shè)置GA3的濃度依次為0、200、300、400、500、700、900 mg·L-1。圖1 不同濃度GA3對金蓮花種子萌發(fā)的影響

注：a為草炭土，b為混合基質(zhì)1，c為混合基質(zhì)2。下同。圖2 幼苗前期生長情況(0～60 d)

表2 不同濃度GA3對金蓮花種子萌發(fā)的影響

GA3濃度/(mg·L-1)萌發(fā)開始時間/d萌發(fā)率/%成苗率/%0(ck)10.44±1.50a24.07±7.95c41.88±11.23c2007.83±1.30b56.29±4.18b53.78±7.26bc3007.88±1.09b55.18±8.54b59.82±7.18ab4002.56±0.88d71.63±7.91a66.11±6.75a5006.22±1.20bc55.18±6.38b60.68±5.59ab70010.78±1.64a14.44±5.26c44.84±8.14bc90010.89±1.36a15.17±5.03c49.94±8.87bc

注：小寫字母表示處理間存在顯著性差異(p<0.05)。下同。

2.1.2不同浸種時間對金蓮花種子萌發(fā)的影響

將金蓮花種子在GA3溶液中浸泡不同時間后催芽，結(jié)果如表3所示。不同浸種時間對種子的發(fā)芽率和成苗率的影響不同，浸種2 d的種子萌發(fā)率、成苗率均顯著高于1 d、3 d的處理，為提高金蓮花萌發(fā)速率的最適宜處理時間。

2.1.3不同浸種溫度對金蓮花種子萌發(fā)的影響

金蓮花種子用400 mg·L-1濃度GA3分別在25 ℃和4 ℃的條件下浸種2 d，然后置于25 ℃的環(huán)境下進行培養(yǎng)，結(jié)果如表4所示。通過獨立樣本T檢驗分析可知，在25 ℃和4 ℃ 2種溫度下浸種后，其萌發(fā)率，成苗率以及萌發(fā)開始時間差異不顯著。因此，不同浸種溫度對金蓮花種子的萌發(fā)基本沒有影響。

2.1.4不同基質(zhì)對金蓮花幼苗生長的影響

將胚根長為3～5 mm的金蓮花種子以點播的方式播種在不同的基質(zhì)中，前期每天澆水保持基質(zhì)濕潤，后期每2～3 d澆1次水。由于金蓮花為多年生草本植物，生長較慢，因此，以2個月為1個時間點將其培養(yǎng)階段分為前期和后期。然后分別對這2個時期幼苗的株高、葉數(shù)及葉幅進行統(tǒng)計對比。試驗結(jié)果及統(tǒng)計0～60 d和61～120 d的幼苗生長情況如表5和圖2、圖3所示，幼苗生長前期，純草炭土中幼苗的株高和葉幅高于其他處理；但3 種處理的葉片數(shù)均在2片左右，差異不顯著。幼苗生長后期與前期生長情況略有差異，3種基質(zhì)在葉數(shù)、葉幅方面均無顯著差異，而混合基質(zhì)2中的幼苗株高顯著高于其他處理。因此，在幼苗生長前期最好用純草炭土培養(yǎng)，而后期則需要儲水性能更好的混合基質(zhì)2作為培養(yǎng)基質(zhì)。

表3 浸種時間對金蓮花種子萌發(fā)的影響

浸種時間/d萌發(fā)開始時間/d萌發(fā)率/%成苗率/%17.58±3.37a41.48±9.35b48.53±8.25b26.75±2.59a51.64±7.58a59.94±6.09a38.54±3.40a39.71±8.64b47.66±9.46b

表4 浸種溫度對金蓮花種子萌發(fā)的影響

浸種溫度/℃萌發(fā)開始時間/d萌發(fā)率/%成苗率/%253.67±1.9772.0±7.3569.43±5.0544.83±2.4878.98±2.5875.06±6.09

圖3 幼苗后期生長情況(61～120 d)

注：a～i依次對應的為ck、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4處理。圖4 金蓮花種子無菌發(fā)芽效果

表6 不同濃度GA3對金蓮花種子萌發(fā)的影響

GA3/(mg·L-1)萌發(fā)開始時間/d萌發(fā)率/%成苗率/%ck10.00±1.00a17.78±1.92b55.56±7.05a40011.67±2.08a17.78±5.09b39.52±6.33a8004.33±0.58b43.33±3.34a53.66±3.57a

2.2無菌條件下不同激素種類及配比對金蓮花種子萌發(fā)的影響

2.2.1不同濃度GA3對金蓮花種子無菌萌發(fā)的影響

金蓮花種子經(jīng)過2種不同條件處理完成后，置于培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，統(tǒng)計其萌發(fā)率和成苗率如表6所示，培養(yǎng)基中種子的萌發(fā)率隨GA3濃度增加而升高。使用800 mg·L-1GA3浸泡過的種子，在培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，與其他處理差異顯著；萌發(fā)開始時間與其他處理相比可縮短一半。因此，采用800 mg·L-1GA3在4 ℃條件下浸種4 d，可使金蓮花種子在培養(yǎng)基中達到較好的萌發(fā)效果。

2.2.2不同激素配比對金蓮花種子無菌萌發(fā)的影響

不同激素種類及濃度配比可以對金蓮花種子的無菌萌發(fā)效果產(chǎn)生直接影響。試驗結(jié)果如表7和圖4所示，采用TDZ、IBA激素組合進行無菌播種，與6-BA與NAA激素組合相比，種子的萌發(fā)率與成苗率相對較高，但發(fā)芽時間無明顯差別。從萌發(fā)率看，當 IBA濃度為0.5 mg·L-1時，種子的萌發(fā)率顯著高于其他處理。從成苗率看，TDZ、IBA激素組合成苗率偏高且穩(wěn)定，處理間無顯著差異，而6-BA與NAA的激素組合成苗率和萌發(fā)率均不及與TDZ和IBA組合的處理。試驗表明，金蓮花種子的最適無菌萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1IBA。

3 討 論

3.1金蓮花種子具有休眠的特性，前人研究表明， GA3可有效打破種子休眠[1,19-24]。本試驗中400 mg·L-1GA3浸種2 d萌發(fā)率最高，可達到71.63%，其結(jié)果相對偏低[22-24]?？赡苁怯捎趯鹕徎ǚN子的處理方法不同、金蓮花種子的產(chǎn)地不同，以及種子貯藏時間過長(2年)、種子飽滿程度低等原因所致。金蓮花種子珍貴，應盡最大程度加以保護利用，因此，為提高其種子的萌發(fā)率，采用GA3浸種時，應根據(jù)種子的具體情況對GA3的濃度及浸種時間作相應調(diào)。

表7 不同激素組合對金蓮花種子萌發(fā)的影響

處理萌發(fā)率/%萌發(fā)開始時間/d成苗率/dck36.67±10.00c6.67±0.57a27.60±7.73bA168.45±1.67a5.00±0.0ab51.11±11.70aA266.67±6.10a5.00±0.0ab55.44±6.07aA352.22±5.09b5.00±0.0ab44.84±4.51aA451.11±6.94b4.33±0.57b42.36±7.64aB138.88±8.78c5.00±0.0ab11.11±9.24bB253.33±8.82b5.00±0.0ab42.40±8.58aB345.55±8.38c4.33±1.53b10.52±6.64bB447.78±5.09b4.00±1.73b53.06±8.34a

3.2關(guān)于金蓮花種子的無菌萌發(fā)，前人已有所研究，如胡海英等人探究出最適無菌條件為MS+0.1 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1IBA；鄭志新等[18]則認為以MS為基本培養(yǎng)基，添加1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA效果最好；而本試驗研究出的最佳培養(yǎng)基與胡海英的結(jié)果接近，且萌發(fā)率可提高到66.45%，萌發(fā)開始時間也可提早，其原因可能是由于采用的GA3濃度較高，以及可能與激素種類以及激素間的相互作用有關(guān)，但具體是哪種因素起主導作用還有待進一步的深入研究。