不同方法提取新疆紅肉蘋果ＲＮＡ差異研究

湯蕾　童盼盼　張亞若　王芳　唐章虎　李文輝　袁祖勝　王江波

摘要：使用生工柱式植物總RNA抽提純化試劑盒、Trnzol法以及改良CTAB 3種方法，提取紅肉蘋果克孜阿爾瑪?shù)墓狻⒐?、花瓣、葉片中的總RNA，并對(duì)比這3種方法提取RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及完整性。結(jié)果表明，由Trnzol方法提取所獲得的RNA純度較低，有降解現(xiàn)象，且有DNA、蛋白質(zhì)的污染，果肉和果皮RNA的產(chǎn)量也并不理想;而用改良CTAB法和生工試劑盒法提取的RNA較少降解，所得28 S rRNA和18 S rRNA條帶較為清晰，花瓣和葉片的OD260/280均在2以上，生工試劑盒法提取的RNA產(chǎn)量高，OD260/280和OD260/230比值均在1.8～2.5，條帶的完整性好。3種方法比較而言，改良CTAB法和TrNzol法提取的RNA條帶的清晰度、產(chǎn)量及質(zhì)量都低于生工試劑盒法。

關(guān)鍵詞：新疆紅肉蘋果;RNA提取;柱式植物總RNA抽提純化試劑盒;Trnzol法;改良CTAB法

中圖分類號(hào)：Q819? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）03-0144-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.032

Study on RNA difference of Xinjiang red meat apple extracted by different methods

TANG Lei1，TONG Pan-pan1，2，ZHANG Ya-ruo1，2，WANG Fang1，TANG Zhang-hu3，

LI Wen-hui4，YUAN Zu-sheng5，WANG Jiang-bo1，2

（1.School of Plant Science，Tarim University， Alar 843300，Xinjiang，China;2.National Local Joint Engineering Laboratory of High efficiency and High quality cultivation and Deep processing Technology of characteristic Fruit trees in Southern Xinjiang，Alar 843300，Xinjiang，China;

3.Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Luntai National Fruit Tree Resource Garden，Luntai 841600，Xinjiang，China;4.Xinjiang production and Construction Corps fourth Division Forestry Management Station，Kedala 835099，Xinjiang，China;5.Agricultural Development Service Center of the 11th regiment of the first Division of the Xinjiang production and Construction regiment，Alar 843300，Xinjiang，China）

Absrtact： The total RNA extraction and purification kit， Trnzol method and improved CTAB method were used to extract the total RNA， from the pulp， pericarp， petals and leaves of red meat apple Kizi Alma， and the results of yield， quality and integrity of the three methods were compared. The final results showed that the purity of RNA extracted by Trnzol method was low， the degradation phenomenon， and the pollution of DNA， protein， the yield of pulp and pericarp was not ideal， but the RNA extracted by improved CTAB method and kit method was rarely degraded. The 28 s rRNA and 18 s rRNA bands were clear， the OD260/280 of petals and leaves was between 1.8 and 2.5， the yield of RNA extracted by raw reagent kit method was high， the ratio of OD260/280 and OD260/230 was between 2.0 and 2.5， and the integrity of the bands was good. Compared with the three methods， the clarity， yield and quality of RNA bands extracted by modified CTAB method and TrNzol method were lower than those by raw reagent kit method.

Key words： Xinjiang red meat apple; RNA extraction; column plant RNA extraction and purification kit; Trnzol method; improved CTAB method

分子生物學(xué)研究對(duì)提取RNA要求較高[1]，獲得純度高、完整性好的RNA是構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫(kù)、進(jìn)行基因表達(dá)和功能鑒定等研究的前提[2]。多糖多酚等物質(zhì)的理化性質(zhì)與RNA類似，因此在RNA形成沉淀時(shí)，多糖物質(zhì)較易生成凝膠狀沉淀，致使形成的RNA難溶于水[3];而紅肉蘋果由于花、葉、果肉呈粉紅色至深紅色，花青苷、酚類含量高，RNA提取難度更大。因此，要獲得完整的、高純度的RNA是一項(xiàng)較困難的工作[4]。

目前，關(guān)于植物總RNA提取方法的報(bào)道有很多，但是由于植物組織及器官本身的特異性，不同研究材料，甚至是同一植物同一材料的不同發(fā)育時(shí)期RNA的提取方法也不同，均需根據(jù)試驗(yàn)分析選取適宜的總RNA提取方法[5]。新疆是紅肉蘋果的起源地，新疆紅肉蘋果資源豐富。目前對(duì)紅肉蘋果的活性成分研究相對(duì)較多的是花青苷，王延玲[6]對(duì)新疆紅肉蘋果夏紅肉的果皮和果肉中花青苷的成分進(jìn)行了鑒定，同時(shí)還研究了在發(fā)育過(guò)程中花青苷含量的變化。而紅肉蘋果中花青苷代謝機(jī)理等許多科學(xué)問(wèn)題需要從分子生物學(xué)水平解析，均需要提取各組織高質(zhì)量的RNA。但是適宜紅肉蘋果的不同組織RNA提取方法的研究報(bào)道較少，因此本試驗(yàn)采用不同方法對(duì)克孜阿爾瑪紅肉蘋果不同組織的RNA進(jìn)行提取，研究出不同方法提取新疆紅肉蘋果RNA的差異，為分子生物學(xué)研究提供了理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以輪臺(tái)特色果樹種質(zhì)資源圃克孜阿爾瑪紅肉蘋果為材料，采其剛展開的幼嫩葉片、盛花期花瓣、成熟果實(shí)，將果實(shí)分成果肉和果皮，各分成數(shù)份裝袋放置于-70 ℃超低溫冰箱保存。

1.2? 試劑與儀器

生工SK8661柱式植物總RNA抽提純化試劑盒;TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技（北京）有限公司）;植物通用抽提試劑（百泰克生物技術(shù)有限公司）;移液槍（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;Nano Drop 2000微量分光光度計(jì)、小型離心機(jī)（ThermoFisher，USA）;電泳儀（北京市六一儀器廠）;熒光和化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;臺(tái)式低速大容量冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3? 方法

1.3.1? 柱式植物總RNA抽提純化試劑盒? 按照生工SK8661柱式植物總RNA抽提純化試劑盒法稍作改動(dòng)。取450 μL裂解液加入1.5 mL離心管中備用。取所需樣品放入研缽中，加液氮快速研磨，取50 mg倒入離心管中，立刻振蕩混勻，室溫放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心3 min，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中。加入1/2體積的75%乙醇，搖勻。將吸附柱放進(jìn)收集管中，所有溶液轉(zhuǎn)入吸附柱，室溫放置2 min，室溫下10 000 r/min離心1 min，棄廢液。再加入1/2體積的75%乙醇，搖勻充分，室溫放置2 min，室溫下10 000 r/min離心1 min。將吸附柱放回收集管中，加入500 μL GT溶液，室溫下10 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入500 μL NT 溶液，室溫放置2 min，室溫下10 000 r/min離心1 min，棄廢液。室溫下12 000 r/min離心2 min。在吸附膜上滴入30 μL DEPC-treated ddH2O，靜置2 min，12 000 r/min離心2 min后置于-70 ℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? TRNzol法? 依照TRNzol法作適當(dāng)?shù)男薷?。?00 mg樣品放入研缽中，加液氮充分研磨，加? ?1 mL TRNzol溶液。金屬浴65 ℃放置5 min，徹底分散核酸蛋白復(fù)合物。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清。加入200 μL氯仿，快速振蕩15 s，室溫靜置3 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，將上層液移入新的離心管，加入等體積異丙醇，迅速渦旋混勻，室溫放置25 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄清液。加入1 mL 75%乙醇。4 ℃ 6 000 r/min離心? ? ?3 min，去上清（洗滌2次，離心2次）。將管蓋打開2～3 min，使管內(nèi)充分晾干，加入30 μL ddH2O。

1.3.3? 改良CTAB法? 在離心管中加入1 mL抽提試劑，備用，取0.1 g樣品放入液氮快速研磨，并移入離心管中，渦旋混勻，65 ℃金屬浴下放置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），渦旋振蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min。棄上清，加入1 mL 75%乙醇，充分混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清。簡(jiǎn)單干燥RNA沉淀3 min，加入30 μL ddH2O溶解RNA沉淀。

1.4? RNA濃度檢測(cè)

用Nano Drop 2000微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA紫外光吸收值，測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)下的光密度值（OD），并記錄RNA的產(chǎn)量以及光密度值[1]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同提取方法對(duì)紅肉蘋果不同組織RNA純度和產(chǎn)量的影響

克孜阿爾瑪紅肉蘋果的各個(gè)組織中，生工試劑盒法和改良CTAB法提取的花瓣和葉片RNA的OD260/280和OD260/230比值均在1.8～2.5，純度較高，無(wú)大量污染，且生工試劑盒法RNA產(chǎn)量高于改良CTAB法，生工試劑盒法測(cè)得的果肉果皮的OD260/280比值在2.0～2.5，OD260/230比值低于1.0，表明存在蛋白質(zhì)及鹽類物質(zhì)污染;TRNzol法提取RNA的OD260/280及OD260/230比值均低于標(biāo)準(zhǔn)值（表1），表明存在大量蛋白質(zhì)或鹽類物質(zhì)以及酚類物質(zhì)污染，提取效果有待于進(jìn)一步純化。

2.2? 不同提取方法對(duì)紅肉蘋果果肉、果皮總RNA完整性的檢測(cè)

取8 μL RNA在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，由圖可1見，用生工試劑盒法提取的蘋果果肉、果皮總RNA中，18 S rRNA和28 S rRNA這兩條帶的帶型與其他兩種方法提取的RNA條帶相比，清晰可見，且降解量很少，28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA的2倍，完整性高;用改良CTAB法提取出的總RNA雖然有條帶出現(xiàn)，但條帶不夠清晰，28 S rRNA和18 S rRNA條帶模糊，有少量降解。TRNzol法提取出的蘋果果肉、果皮RNA在凝膠上無(wú)法成像，說(shuō)明該法無(wú)法很好地提取含有大量多糖多酚物質(zhì)的植物組織RNA。

2.3? 不同提取方法對(duì)紅肉蘋果花瓣、葉片總RNA完整性檢測(cè)

取8 μL提取的花瓣和葉片RNA在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，通過(guò)圖2可知，生工試劑盒法提取花瓣及葉片RNA的條帶較其他兩種方法清晰許多，有少許降解，可見28 S rRNA和18 S rRNA兩條帶型，28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA條帶的2倍。TRNzol法提取的RNA雖然可以看到28 S rRNA、18 S rRNA和5 S rRNA這3條帶型，但提取的RNA完整性并非最佳，花瓣RNA條帶中28 S rRNA和18 S rRNA不是2倍關(guān)系，條帶較淡，有拖帶現(xiàn)象，完整性較低;葉片RNA條帶點(diǎn)樣孔較亮，表明有DNA殘留。改良CTAB法提取的RNA條帶可以看出兩條帶型，雖無(wú)拖帶現(xiàn)象，但條帶亮度不高，完整性低。

3? 結(jié)論

不同RNA提取方法對(duì)不同物種、不同器官及不同組織的提取效率不盡相同。目前，科研人員已經(jīng)總結(jié)出許多科學(xué)高效的RNA提取方法[7]，但是在實(shí)際操作中，即使相同種屬的不同個(gè)體，采用同一套固定的提取方法也無(wú)法保證取得同樣的效果[8，9]。TRNzol法是一種提取植物RNA的常用方法，在許多植物中均可分離到高質(zhì)量的RNA，但是在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TRNzol法并不能有效的去除蘋果果肉及果皮中的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等物質(zhì)，最終提取出來(lái)的RNA嚴(yán)重降解。

改良CTAB法成本低廉，步驟簡(jiǎn)單，提取出的RNA產(chǎn)量也較高，此方法雖然能有效的提取出蘋果各組織中的RNA，但是其中混有少量的雜質(zhì)，質(zhì)量不高。

生工柱式植物總RNA提取純化試劑盒雖然價(jià)格昂貴，但是操作簡(jiǎn)便，提取快速簡(jiǎn)潔，RNA的純度高，完整性好，RNA的產(chǎn)量高，適用于小量樣品的提取，且可以有效進(jìn)行RT-PCR分析等后續(xù)試驗(yàn)。

分離完整的總RNA是對(duì)蘋果進(jìn)行分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，本次試驗(yàn)可應(yīng)用于分子生物學(xué)角度的分析，同時(shí)，也為新疆的紅肉蘋果的后續(xù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李志強(qiáng)，李? 瑩，陶建敏，等.幾種果實(shí)不同組織總RNA提取及質(zhì)量分析[J].果樹學(xué)報(bào)，2008（5）：764-768.

[2] 陳? 暉，何海福.植物組織總RNA提取方法的進(jìn)展研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)，2006（8）：226.

[3] 宋成秀，張利義，張彩霞，等.適合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的蘋果果實(shí)RNA提取方法的篩選[J].中國(guó)果樹，2015（2）：47-49，61.

[4] 張建秋，陸 海，杜希華，等.白刺總RNA提取方法的研究[J].成都大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，23（1）：9-14.

[5] 馮延芝，袁德義，張? 琳，等.棗花蕾總RNA提取方法的比較[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2012，30（2）：88-90.

[6] 王延玲.新疆紅肉蘋果紅色發(fā)育機(jī)理的初步研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[7] 鞏艷明，曹后男，宗成文，等.三種方法提取不同品種梨葉片總 RNA[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（15）：3204-3206.

[8] 龐宏光，許建鋒，張江紅，等.杜梨不同組織總RNA提取方法比較及質(zhì)量分析[J].果樹學(xué)報(bào)，2018，35（S1）：66-70.

[9] 王? 艷，高疆生，金? 強(qiáng)，等.不同RNA提取方法在南疆特色果樹上的應(yīng)用[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52（3）：461-466.

收稿日期：2019-10-13

基金項(xiàng)目：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)-塔里木大學(xué)科研聯(lián)合基金項(xiàng)目（TDHNLH201601）;兵團(tuán)南疆重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2017DB006-2）

作者簡(jiǎn)介：湯? 蕾（1997-），女，新疆烏魯木齊人，在讀本科生，專業(yè)方向?yàn)榉肿由锛夹g(shù)，（電話）18099096131（電子信箱）734573781@qq.com;? ?通信作者，王江波（1978-），女，副教授，碩士，主要從事果樹育種與生物技術(shù)研究，（電子信箱）wjbok@126.com。