ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法測(cè)定火鍋底料中三種喹噁啉類藥物

馬曉年　段海波　鄒艷麗　張秀清　梁志堅(jiān)　陳俊秀

摘要：采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)火鍋底料中3種喹噁啉藥物，樣品經(jīng)過乙腈-乙酸乙酯提取后，以乙腈-0.2%甲酸作為流動(dòng)相，采用多反應(yīng)檢測(cè)正離子模式進(jìn)行定性及定量分析。結(jié)果表明，3種喹噁啉類藥物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，不同濃度的平均加標(biāo)回收率在66.5%～84.4%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.8%～9.2%，該方法適用于火鍋底料中3種喹噁啉類藥物殘留的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：3-甲基喹噁啉-2-羧酸;乙酰甲喹;喹烯酮;UPLC-MS/MS;火鍋底料

中圖分類號(hào)：O657.63;TS264.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）03-0126-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.027

Determination of 3 quinoxaline drugs in hotpot seasoning by UPLC-MS/MS

MA Xiao-nian1，DUAN Hai-bo2，ZOU Yan-li3，ZHANG Xiu-qing1，LIANG Zhi-jian1，CHEN Jun-xiu1

（1.Kunming Center for Disease Control and Prevention，Kunming 650228，China;2.Yunnan Tobacco Industry Co.，Ltd. Technology Center，Kunming 650231，China;3.Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunnan，China）

Abstract： UPLC-MS/MS was used to simultaneously detect three quinoxaline drugs in the hotpot seasoning. After the sample was extracted by acetonitrile ethyl acetate， acetonitrile-0.2% formic acid water was used as the mobile phase， and the multi reaction detection positive ion mode was used for qualitative and quantitative analysis. The results show that the linear relationship of the three quinoxaline drugs is good， the correlation coefficient is above 0.999， the average recovery of different concentration is 66.5%～84.4%， and the average relative standard deviation is 6.8%～9.2%. This method is suitable for the detection of? residual pollution in hotpot seasoning.

Key words： methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid; mequindox; quinocetone; UPLC-MS/MS; hotpot seasoning

3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、乙酰甲喹（MEQ）、喹烯酮（QCT）均屬喹噁啉類化藥物，該類藥物可顯著促進(jìn)動(dòng)物生長，且具有較強(qiáng)的抑菌作用[1]，廣泛用于豬、牛、雞、羊的促進(jìn)生長、抗菌治病。但該類化合物有較強(qiáng)的蓄積毒性和遺傳毒性，其在動(dòng)物體內(nèi)造成的殘留嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的健康。有學(xué)者對(duì)喹噁啉類藥物殘留從前處理到分析方法進(jìn)行了研究[2-7]，并分析了不同種類的樣品。在前人研究工作的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了火鍋底料中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、乙酰甲喹（MEQ）、喹烯酮（QCT）的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑

QTRAP 4500質(zhì)譜分析儀（美國 AB SCIEX）;Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫）;高速冷凍離心機(jī)（湖南 赫西儀器）;振蕩器（常州金壇恒豐儀器制造有限公司）;超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;氮吹儀（Reeko Auto EVA-30）;電子天平（METTLER，0.01 mg）;均質(zhì)器。

3-甲基喹噁啉-2-羧酸（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH），乙酰甲喹（BEIJING MANHAGE BIO-TECH CO.，LTD.），喹烯酮（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH）;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸均為色譜純;濃鹽酸、正己烷均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2? 方法

1.2.1? 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制? 分別稱取MQCA、MEQ、QCT標(biāo)準(zhǔn)品4.30、3.30、4.10 mg，用甲醇溶解并定容至20 mL制成母液。再取MQCA、MEQ、QCT各50 μL定容至50 mL棕色容量瓶中，配成MQCA、MEQ、QCT濃度分別為215、165、205 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。使用時(shí)根據(jù)需要配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2? 樣品前處理? 稱取5.00 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的火鍋底料樣品至50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），混勻后置于（47±3） ℃水浴振搖15 min，超聲提取10 min，10 ℃ 7 000 r/min離心8 min，收集上層有機(jī)相，殘?jiān)性偌尤?5 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），重復(fù)上述步驟再提取1次，合并上層有機(jī)相。

向乙腈-乙酸乙酯提取后的殘?jiān)屑尤?0 mL磷酸鹽緩沖液，置于（47±3） ℃水浴振搖15 min，超聲提取10 min，10 ℃ 7 000 r/min離心8 min，收集上清液與上述有機(jī)相合并。于40 ℃下氮?dú)獯抵两?，加?.5 mL含0.1%甲酸的20%甲醇溶液溶解殘留物，加入1 mL正己烷振蕩脫色，7 000 r/min離心8 min，除去正己烷層，下層過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS-MS測(cè)定。

1.3? UPLC-MS/MS條件

1.3.1? UPLC條件? 色譜柱：島津Inertsil ODS-3柱（3 μm，2.1 mm×100 mm）;流動(dòng)相A為0.2%甲酸-水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1;流速0.30 mL/min，分析時(shí)間為5 min，進(jìn)樣體積5 μL，柱溫30 ℃。

1.3.2? 質(zhì)譜條件? 電離電壓4.5 kV;多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）;離子源溫度450 ℃;噴霧器壓力275.8 kPa;氣簾氣壓力241.325 kPa;輔助氣流速40 μL/min;其他參數(shù)見表2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 提取溶劑的選擇

采用各類溶劑提取動(dòng)物源性食品中喹噁啉類藥物殘留已有文獻(xiàn)報(bào)道，常用有乙腈、甲醇、乙酸乙酯等單一溶劑體系或二相、三相溶劑體系。本研究比較了乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈-甲醇-乙酸乙酯（1∶1∶1）、乙腈-甲醇（1∶1）、甲醇-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈、甲醇、甲醇-水（1∶1）、乙腈-水（1∶1）的提取效果。結(jié)果表明，甲醇-水（1∶1）及乙腈-水（1∶1）的提取效果不佳，而其他溶劑體系均有一定的提取率，其中乙腈-乙酸乙酯（1∶1）及甲醇-乙酸乙酯（1∶1）提取率最高，回收率均能達(dá)75%以上。乙腈提取時(shí)，雜質(zhì)相對(duì)較少，能減輕離子源的負(fù)擔(dān)。乙酸乙酯對(duì)脂溶性大的MEQ和QCT有較好的提取率，故本研究采用乙腈-乙酸乙酯（1∶1）作為提取溶劑。

2.2? 基質(zhì)效應(yīng)的消除

在應(yīng)用LC-MS/MS測(cè)定復(fù)雜樣品（如動(dòng)物源食品及生物樣本）時(shí)，基質(zhì)通常對(duì)分析物的離子化具有增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，此為基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)影響儀器的靈敏度和重復(fù)性，是可靠定性及準(zhǔn)確定量的重要影響因素。主要采用以下手段減少基質(zhì)效應(yīng)：①通過優(yōu)化色譜分離條件使得內(nèi)源性雜質(zhì)與待測(cè)物分離;②保留時(shí)間靠前，比較容易受基質(zhì)效應(yīng)的影響，試驗(yàn)適當(dāng)?shù)卦黾哟郎y(cè)組分的分離時(shí)間，使之在2 min后出峰以減少基質(zhì)效應(yīng);③采用較低流速使同時(shí)離子化的化合物減少，降低待測(cè)組分與基質(zhì)成分在電離過程中的競(jìng)爭(zhēng)，從而減弱基質(zhì)效應(yīng);④在保證靈敏度的情況下，采用小進(jìn)樣體積降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.3? 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)有機(jī)相分別采用了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合溶液，水相分別采用了含0.1%甲酸、含0.2%甲酸，將有機(jī)相和水相進(jìn)行兩兩搭配進(jìn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈有改善峰形的作用， 0.1%甲酸-乙腈及0.2%甲酸-乙腈均能分離測(cè)定兩個(gè)物質(zhì)，但在0.2%甲酸-乙腈體系下，待測(cè)組分的響應(yīng)較高且峰形窄。圖1為各流動(dòng)相下的TIC圖?？紤]到操作的簡(jiǎn)便及分離的效果，試驗(yàn)最終確定流動(dòng)相為0.2%甲酸-乙腈。

2.4? 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)待測(cè)物的性質(zhì)，配制MEQ、MQCA、QCT濃度分別為165、215、205 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在ESI+模式下分別進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化，第一步進(jìn)行母離子掃描，確定母離子，優(yōu)化得到去簇電壓和碰撞電壓。并在MRM模式下優(yōu)化了氣簾氣、離子源溫度、噴霧氣、輔助加熱氣。

2.5? 方法研究及結(jié)果分析

2.5.1? 線性范圍、回歸方程和檢出限? 分別配制MQCA的質(zhì)量濃度為4.3、21.5、43.0、129.0、215.0 μg/L，MEQ的質(zhì)量濃度為3.3、33.0、99.0、165.0、264.0 μg/L，QCT的質(zhì)量濃度為4.1、20.5、41.0、123.0、205.0 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)組分的峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種化合物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限見表3。

2.5.2? 方法回收率和精密度? 空白樣品每份5.00，共3組，分別添加7.5、15.0、30.0 ng MQCA，5.0、15.0、30.0 ng MEQ，7.5、15.0、30.0 ng QCT，測(cè)定結(jié)果見表4。從表4可以看出，不同濃度的平均加標(biāo)回收率在66.5%～84.4%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.8%～9.2%。圖2為標(biāo)準(zhǔn)品及加標(biāo)樣品中MRM色譜。

3? 結(jié)論

建立了同時(shí)檢測(cè)火鍋底料中3-甲基喹噁啉-2-羧酸、乙酰甲喹、喹烯酮?dú)埩舻腢PLC-MS/MS分析方法，通過對(duì)樣品處理?xiàng)l件和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，使得方法簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏、穩(wěn)定，可滿足火鍋底料中3種喹噁啉類藥物殘留的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[2] 吳永寧，邵? 兵，沈建忠.獸藥殘留檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)[M].北京：化學(xué)出版社，2007.

[3] 馬曉年，張秀清，張瑞雨，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定純牛奶中喹乙醇及其代謝物[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2018，30（6）：602-605.

[4] 陳俊秀，張秀清，李文廷，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶酪中喹乙醇及其代謝物[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（12）：3171-3176.

[5] 吳劍平，張? 鑫，李丹妮，等.在線固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)飼料中5種喹噁啉藥物殘留量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2015， 34（5）：610-615.

[6] 黃學(xué)泓，張林田，張冬輝.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定全價(jià)飼料中5種喹噁啉類藥物[J].飼料研究，2015（11）：48-52.

[7] 范立鵬，段振娟，方國臻，等.動(dòng)物源性食品中喹噁啉類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報(bào)，2012，12（9）：171-178.

收稿日期：2019-06-10

基金項(xiàng)目：昆明市衛(wèi)生人才科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目[2017-sw（后備）-66]

作者簡(jiǎn)介：馬曉年（1985-），女（壯族），云南臨滄人，主管技師，碩士，主要從事食品質(zhì)量與安全工作，（電話）13888021164（電子信箱）179267837@qq.com;通信作者，陳俊秀（1988-），女，云南玉溪人，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事理化分析工作，（電子信箱）752110643@qq.com。