抗菌植物培養(yǎng)基的制備及抗菌性能研究

張芯　陳婧雯

摘要：通過液相還原硝酸銀得到納米銀粒子，然后將其添加入植物組織培養(yǎng)基中，從而得到一種抗菌的復(fù)合培養(yǎng)基，實現(xiàn)植物組織的開放式培養(yǎng)。試驗主要包括納米銀粒子的制備及復(fù)合培養(yǎng)基的制備。首先，采用一種綠色無毒的方法，利用果糖和葡萄糖作為還原劑還原AgNO3溶液，同時研究硝酸銀濃度對納米銀粒子粒徑的影響。在此基礎(chǔ)上，制備出納米銀粒子復(fù)合的B5培養(yǎng)基。結(jié)果表明，隨著AgNO3溶液濃度的升高，納米銀粒子的尺寸增大，粒徑分布范圍變寬;抗菌測試結(jié)果表明，納米銀粒子復(fù)合的B5培養(yǎng)基具有顯著的抗菌性能。

關(guān)鍵詞：植物培養(yǎng)基;納米銀;抗菌性能

中圖分類號：Q-331? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）03-0079-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.015

Preparation of antimicrobial plant medium and research of its antibacterial properties

ZHANG Xin1，2，3，CHEN Jing-wen1

（1.Department of Chemistry and Chemical Engineering/Research Centre of New Materials，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China; 2.Engineering Research Center of Iron/Aluminum Based Nano-materials，Ankang 725000，Shaanxi，China;3.Engineering Research Center of Zinc-based Nanomaterials，Ankang 725000，Shaanxi，China）

Abstract： Nanosilver particles were obtained by liquid phase reduction of AgNO3， and nanosilver composite plant medium with good antimicrobial capability was successfully prepared to realize open culture of plant tissues. The experiment mainly included the preparation of nanosilver particles and the preparation of composite plant medium. First， nanosilver particles were prepared in AgNO3 solution using fructose and D-glucose as reduction reagents. The effect of AgNO3 concentration on the nanoparticle size was investigated. Second， the solvent containing the nanosilver particles was added in B5 medium to form a composite plant medium. It was found that with the increase of AgNO3 solution concentration， the average size of nanosilver particles increased， and the size distribution range became wider. Moreover， the composite B5 medium containing the nanosilver particles exhibited significant antimicrobial capability.

Key words： plant medium; nanosilver; antimicrobial capability

污染是組織培養(yǎng)中普遍存在的問題[1]。在植物繁殖生長過程中，接種器具、培養(yǎng)基滅菌不嚴(yán)格以及操作不規(guī)范等因素都會導(dǎo)致污染的發(fā)生。此外，在傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)過程中，植物自身攜帶的細(xì)菌由于難以被清除，而會被帶入培養(yǎng)基中，引起污染。這些因素使得傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)植物生長緩慢、存活率低，抑制了植物組織培養(yǎng)在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用與推廣[1-3]。隨著研究的不斷深入，植物開放式培養(yǎng)的概念被提了出來。如果植物可以在相對開放的條件下生長，既能簡化組織培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)，降低生產(chǎn)成本，又有利于植物組織培養(yǎng)的工廠化、規(guī)模化發(fā)展。且在實踐過程中發(fā)現(xiàn)，開放式組織培養(yǎng)對空氣中的雜菌沒有抵抗能力[4]，如果將抗菌劑加入到培養(yǎng)基中，將會使開放式組織培養(yǎng)具有可行性。

納米銀粒子具有天然的殺菌性能，對大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體等數(shù)十種致病微生物都有強烈的抑制和殺滅作用，極少的納米銀就可產(chǎn)生強大的殺菌作用[5-7]。因此如果能將銀粒子引入到植物組織培養(yǎng)基中，將使培養(yǎng)基具有抗菌功能。納米銀粒子的制備通常采用液相化學(xué)還原法，利用適當(dāng)?shù)倪€原劑在液相中將銀鹽還原而得到納米銀粒子，常用的還原劑主要有雙氧水、甲醛、檸檬酸鈉、水合肼、抗壞血酸、葡萄糖、果糖等[8-10]。

本試驗將在水相體系中還原硝酸銀溶液得到納米銀溶膠。室溫下，利用果糖和葡萄糖為還原劑，同時研究硝酸銀的濃度對納米銀粒子粒徑的影響。與使用有機溶劑作為還原試劑相比，使用果糖和葡萄糖更加綠色環(huán)保，且糖可以同時作為植物培養(yǎng)基的能源物質(zhì)。制備出的納米銀粒子被添加入B5培養(yǎng)基（一種銨含量較低的植物培養(yǎng)基）中，并測試該復(fù)合培養(yǎng)基的抗菌性能。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試劑? 硝酸銀（AgNO3，天津市天感化工技術(shù)開發(fā)有限公司，分析純）;果糖、葡萄糖（C6H12O6，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純）;氫氧化鈉（NaOH，天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純）;25%～28%氨水（NH3·H2O，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）;B5培養(yǎng)基（含瓊脂、蔗糖，杭州木木生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2? 儀器? 透射電子顯微鏡（TEM，日立H-7650）。

1.2? 納米銀粒子復(fù)合的植物組織培養(yǎng)基的制備

1.2.1? 納米銀溶膠的制備? 40 ℃下，量取25 mL以上配制好的AgNO3溶液（濃度分別為1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2 mol/L）于三口瓶中，加入5 mL 0.05 mol/L氨水溶液，將三口瓶置于磁力攪拌器上攪拌，溶液混合均勻后分別加入10 mL 0.15 mol/L果糖溶液、5 mL 0.01 mol/L葡萄糖溶液，接著加入幾滴0.1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)整個溶液的pH為9左右，反應(yīng)1.5 h。

1.2.2? 納米銀粒子的表征? 觀察納米銀溶膠體系的顏色變化，并利用透射電子顯微鏡觀察樣品的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步確定納米銀顆粒的尺寸及粒徑分布情況。

1.2.3? 納米銀粒子復(fù)合的B5培養(yǎng)基的制備? 將3.02 g B5干粉培養(yǎng)基溶解于100 mL去離子水中，加熱至完全溶解，然后向其中加入10 mL納米銀粒子溶膠，混合均勻，趁培養(yǎng)基未凝固倒入潔凈的表面皿中。

1.3? 抗菌性能測試

為了考察植物組織培養(yǎng)過程中納米銀粒子的加入是否會抑制空氣中雜菌的滋生，選用新鮮草莓作為培養(yǎng)材料。還原濃度為1.0×10-4 mol/L AgNO3溶液得到的納米銀溶膠被添加到B5培養(yǎng)基中，將新鮮的草莓薄片置于復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時以未添加納米銀粒子的B5培養(yǎng)基作為對照。這兩種培養(yǎng)基不經(jīng)過滅菌處理直接暴露于空氣中培養(yǎng)，觀察并記錄空氣中雜菌的生長情況。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 納米銀粒子的表征

反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)，伴隨著反應(yīng)的發(fā)生，溶液的顏色開始變化，由最初的無色透明液變?yōu)樽攸S色（圖1）。這是由納米銀粒子的表面等離子體共振現(xiàn)象引起的[11]。

圖2是還原不同濃度的AgNO3制備出的納米銀粒子的TEM圖。從圖2可以看出，制備出的納米銀粒子都為不規(guī)則的球形，且分散性較好。當(dāng)AgNO3濃度為1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2 mol/L時，制備出的納米銀粒子的平均粒徑分別為48、55、66 nm，說明隨著AgNO3濃度的增加，還原出的納米銀粒子的尺寸增大。將以上3種濃度的AgNO3作對比，發(fā)現(xiàn)AgNO3濃度為1.0×10-2 mol/L時，制備出的納米銀粒子中出現(xiàn)了塊狀的銀顆粒，且粒徑分布范圍較寬，在45～98 nm。

2.2? 抗菌性能測試

圖3展示了草莓在兩種不同的B5培養(yǎng)基上的培養(yǎng)狀態(tài)。第五天，未加納米銀溶膠的體系中，草莓表面及與瓊脂接觸的周圍都有霉菌，培養(yǎng)基表面也有霉菌產(chǎn)生;相反，復(fù)合納米銀粒子的B5培養(yǎng)基上沒有出現(xiàn)霉菌，只有草莓與空氣接觸的表面有一些零星的霉點，草莓與培養(yǎng)基接觸的周圍也沒有發(fā)霉的跡象，說明加入納米銀粒子的復(fù)合B5培養(yǎng)基具有顯著的抗菌效果。

3? 小結(jié)與討論

本試驗以AgNO3為原料，以果糖為還原劑，成功制備出不同粒徑的球形納米銀粒子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AgNO3濃度分別為1.0×10-4、1.0×10-3、1.0×10-2 mol/L時，制備出的納米銀粒子的平均粒徑分別為48、55、66 nm，且伴隨著AgNO3濃度的升高，納米銀粒子的尺寸增大，粒徑分布范圍變寬。將納米銀粒子添加到B5植物培養(yǎng)基中，得到的復(fù)合培養(yǎng)基有顯著的抗菌性能。

參考文獻(xiàn)：

[1] 方潤善，候? 闖.植物組織培養(yǎng)的研究與應(yīng)用概況[J].中國高新技術(shù)企業(yè)，2010（36）：24-32.

[2] 周俊輝.植物快速繁殖技術(shù)中存在的問題與對策[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，1999，12（4）：64-70.

[3] 朱廣廉.植物組織培養(yǎng)中的外植體滅菌[J].植物生理學(xué)通訊，1996，32（6）：444-449.

[4] 崔? 剛，單文修，秦? 旭，等.植物開放式組織培養(yǎng)研究初探[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，35（4）：529-533.

[5] SONDI I，SILVER B，SALOPEK S. Silver nanoparticles as antimicrobial agent：A case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria[J].Journal of colloid and interface science，2004，275（1）：177-182.

[6] ALT V，BECHERT T，STEINRUCKE P，et al. An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate silver bone cement[J].Biomaterials，2004，25（18）：4383-4391.

[7] 董耀華，郭? 娜，劉? 濤.納米銀的制備及其抑菌機理[J].上海海事大學(xué)學(xué)報，2013，34（1）：80-83.

[8] 代小英，許? 欣，陳昭斌.納米銀制備方法概述[J].中國消毒學(xué)雜志，2007，24（6）：561.

[9] 王迎春，宗彥芳，藍(lán)? 蓉.納米銀的制備及其表征[J].金屬功能材料，2013，20（2）：27-30.

[10] 孫紅剛.次磷酸鈉液相化學(xué)還原法制備納米銀粉的研究[D].成都：四川大學(xué)，2005.

[11] VIJAYAKUMAR M，PRIYA K，NANCY F T，et al. Biosynthesis，characterisation and anti-bacterial effect of plant-mediated silver nanoparticles using Artemisia nilagirica[J].Industrial crops and products，2013，41（1）：235-240.

收稿日期：2019-05-15

基金項目：安康學(xué)院科技扶貧專項（2018FPZX01）;陜西省科技廳平臺子項目（2018PT-31）;安康市重大科研攻關(guān)項目（2016AKZDCY002）

作者簡介：張? 芯（1987-），女，陜西安康人，講師，碩士，主要從事納米材料制備及應(yīng)用研究，（電話）18291529057（電子信箱）zhangxin0621@sina.com。