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    近紅外熒光探針的合成、表征及應(yīng)用分析

    2020-05-18 02:41:13馮碩
    科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2020年14期

    馮碩

    摘? 要:近紅外熒光探針的發(fā)射波長能避免生物組織的干擾,對生物成像有較高的效率。文章對鈀檢測、N2H4檢測、苯硫酚檢測作為近紅外熒光探針的合成、表征及具體在細胞中應(yīng)用的分析。希望能為近紅外熒光探針的更多應(yīng)用和發(fā)展趨勢做出不一樣的分析方向。

    關(guān)鍵詞:近紅外熒光探針;鈀檢測;N2H4檢測;苯硫酚檢測

    中圖分類號:O657.33? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼:A? ? ? ? ?文章編號:2095-2945(2020)14-0095-02

    Abstract: The emission wavelength of near-infrared fluorescence probe can avoid the interference of biological tissue and has high efficiency for biological imaging. In this paper, palladium detection, N2H4 detection, thiophenol detection as near-infrared fluorescence probe synthesis, characterization and specific application in cells were analyzed. It is hoped that it can make a different analysis method for more applications and development trends of near-infrared fluorescence probes.

    Keywords: near-infrared fluorescence probe; palladium detection; N2H4 detection; thiophenol detection

    多數(shù)熒光探針有著自身限制,具體表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上和形態(tài)上的差異,所以大多數(shù)的熒光探針的發(fā)射波長被限制在了650nm之下,因此不能準(zhǔn)確靈敏地去進行細胞內(nèi)成分檢測,會被樣品的發(fā)射波長所干擾。

    但近紅外熒光探針在這方面有很好的改進之處,發(fā)射波長超過650nm,能夠避免樣本的自發(fā)熒光干擾,從而將熒光的化學(xué)分析和生物熒光成像做到高靈敏度,所以近紅外熒光探針的應(yīng)用越來越廣,準(zhǔn)確度也越來越高,幫助科研院所更快地取得了眾多的成果研究。

    1 近紅外熒光探針的合成、表征

    1.1 近紅外熒光探針CyPd的合成、表征

    1.1.1 探針CyPd的合成

    在對探針CyPd的合成中,要在一個充分安全的環(huán)境保護下進行合成的操作,選用較為穩(wěn)定的零攝氏度和安全氣體氮來作為基礎(chǔ)環(huán)境。將Cy化合物與三乙胺共同溶解,并和二氯甲烷溶液混合。再接下來將此混合溶液靜置,把六甲酸稀丙酯滴進此溶液,為保證安全性與實驗效果,需采用注射器的方式逐滴混合攪拌約30分鐘,室溫過夜。最后將此溶液進行減壓蒸發(fā)得到固化物,此時的粗產(chǎn)品還需經(jīng)過硅膠柱提純則可得到探針CyPd,外形為藍色固體。

    1.1.2 探針CyPd的表征

    在熒光成像分析中,可以看到探針CyPd的溶液顏色在不同的操作下有明顯的變化。比如加入了緩沖溶液后,探針CyPd的熒光成像有明顯的減弱趨勢;在694nm的發(fā)射波長下,顏色由紫變藍;發(fā)射波長為721nm時的感光強度最強,熒光成像圖中呈現(xiàn)一波高峰。

    1.2 近紅外熒光探針DCMC的合成、表征

    1.2.1 探針DCMC的合成

    探針DCMC的合成依舊要在氮氣保護下進行合成實驗,目的是在探針DCMC的制取中隔絕氧氣,以防止元素在氧氣中產(chǎn)生氧化還原反應(yīng),影響實驗的中間產(chǎn)物以致結(jié)果的不理想。將DCM的化合物與三乙胺共同溶解,并和二氯甲烷溶液混合。再接下來將此其中反應(yīng)溫度要控制在零攝氏度后靜置,把乙酰氯溶液滴進此混合溶液,為保證安全性與實驗效果,需采用注射器的方式逐滴混合,約預(yù)留出反應(yīng)時間30分鐘后進行減壓蒸發(fā)得到固化物,此時的粗產(chǎn)品還需經(jīng)過用占比為50份的二氯甲烷比1份的甲醇利用硅膠柱提純法精提純,則可得到探針DCMC,外形為黃色固體。

    1.2.2 探針DCMC的表征

    在熒光成像分析中,肉眼可見加入了探針DCMC的溶液顏色在不同的操作下有明顯的變化。比如不同濃度的N2H4溶液在加入到探針DCM溶液中,顏色由淡黃變成紫紅;另外根據(jù)熒光光譜來看,沒加入N2H4,未顯示有熒光反應(yīng)和紫外線吸收現(xiàn)象;加入N2H4后,則有很強的熒光反應(yīng),借此證明了近紅外熒光探針DCMC對N2H4的檢測效果。

    1.3 近紅外熒光探針DCM-CHO-D的合成、表征

    1.3.1 探針DCM-CHO-D的合成

    探針DCM-CHO-D的合成要在氮氣保護下進行,目的是在探針DCM-CHO-D的制取中防止各個活躍元素在含有氧氣的反應(yīng)環(huán)境中產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng),以致實驗結(jié)果的不嚴(yán)謹(jǐn)。將探針DCM-CHO-D與三乙胺都按順序加入到二氯甲烷溶液中并使其充分溶解,將反應(yīng)溫度要控制在零攝氏度后靜置得到溶液一。然后需要制備把2,4-二硝基苯磺酰氯溶于二氯甲烷的混合溶液,得到溶液二,使用注射器把溶液二滴進溶液一中,在零攝氏度的反應(yīng)溫度下約預(yù)留出反應(yīng)時間10分鐘后,攪拌充分室溫過夜。進行減壓蒸發(fā)法得到固化物,此時的粗產(chǎn)品還需經(jīng)過用到占比為50份的二氯甲烷比1份的甲醇作為洗脫劑,利用色譜硅膠柱提純法精提純,則可得到探針DCM-CHO-D,外形為紅色粉末[1]。

    1.3.2 探針DCM-CHO-D的表征

    本實驗所選的細胞為HeLa,進行目標(biāo)細胞的選取后,將其置于96孔板中,期間要注意保證細胞的貼壁,培養(yǎng)時間控制在約24小時。然后用PBS溶液進行洗滌,洗滌次數(shù)三次為宜,加入探針DCMC做繼續(xù)培養(yǎng),時間控制在約30分鐘,培養(yǎng)結(jié)束再次用PBS溶液進行三次洗滌,繼而在顯微鏡下進行對HeLa細胞的熒光成像分析。接著再加入苯硫酚溶液在培養(yǎng)基中進行細胞孵育約30分鐘,再次用PBS溶液進行三次徹底的洗滌,使培養(yǎng)基中能夠去除殘留的苯硫酚成分。最后用熒光顯微鏡對HeLa細胞熒光成像分析。

    檢測苯硫酚使用近紅外熒光探針DCM-CHO-D,在加入了探針DCM-CHO-D后待測苯硫酚溶液顏色在不同的操作下有不同的變化。比如不同濃度的苯硫酚溶液在加入到探針DCM-CHO-D溶液中,顏色由淡黃變成粉紅;另外根據(jù)熒光光譜來看,沒加入大劑量的苯硫酚溶液前的緩沖液中,僅顯示有較微弱的熒光反應(yīng)和紫外線吸收現(xiàn)象;加入N2H4后,則有很強的熒光反應(yīng),在一定范圍內(nèi)苯硫酚的加入與熒光強度呈正相關(guān)。

    2 近紅外熒光探針的應(yīng)用分析

    2.1 近紅外熒光探針對鈀檢測的應(yīng)用分析

    2.1.1 對鈀檢測的應(yīng)用機理

    鈀檢測是使用探針CyPd來作為近紅外熒光探針的選擇,探針CyPd其中有作為信號作用的CyH、起到識別作用的碳酸烯丙酯,二者的相互配合,將電荷的轉(zhuǎn)移隔斷,從而起到能夠發(fā)射熒光波長和接收并吸收紫外照射的作用。熒光光譜的顯示其實就是反映了待測樣本其中的電荷移動趨勢,當(dāng)探針CyPd對鈀的檢測中,熒光光譜的波峰有明顯的波動范圍,說明探針CyPd對紫外線的吸收和對熒光的反射有較高的敏感度,進一步證明近紅外熒光探針CyPd能夠?qū)︹Z檢測的最終實驗數(shù)據(jù)做充分的數(shù)據(jù)保證[2]。

    2.1.2 應(yīng)用于細胞中的檢測

    在對選用的HeLa細胞中的檢測,為了防止細胞被損壞,可以進行不對細胞造成損害的細胞成像的影像技術(shù)來觀察近紅外熒光探針CyPd對鈀檢測的應(yīng)用。首先要保持HeLa細胞的活性,不要對細胞膜的通透性產(chǎn)生影響,這樣對鈀的檢測會出現(xiàn)數(shù)據(jù)偏差。實驗檢測在鈀元素的不同價態(tài)下,作為是化合物的PdCl2是危害最大、毒性最強的存在,所以實驗選擇PdCl2作為HeLa細胞成像的關(guān)鍵要素。數(shù)據(jù)顯示,在沒有加入鈀元素化合物前,熒光光譜未顯示有熒光反應(yīng),在加入了PdCl2之后,熒光反應(yīng)強烈。所以證明了近紅外熒光探針CyPd對鈀檢測的實驗中,探針CyPd對鈀元素的檢測及時且準(zhǔn)確,而且很好地穿透了細胞膜且并未對細胞活性產(chǎn)生影響。

    2.2 近紅外熒光探針對N2H4檢測的應(yīng)用分析

    2.2.1對N2H4檢測的應(yīng)用機理

    探針DCMC對N2H4進行檢測,是因為探針DCMC中含有信號集團和識別基團,分別是由DCM-OH負責(zé)發(fā)出信號、乙?;撠?zé)識別信號作為對N2H4進行檢測工作原理。近紅外熒光探針DCMC里DCM-OH信號基團被識別基團乙?;Wo在內(nèi)核部分,做熒光檢測時,由于能夠發(fā)出信號的DCM-OH被包含在內(nèi)部,熒光發(fā)出波長但不能與分子內(nèi)電荷發(fā)生反應(yīng)所以會顯示熒光猝滅;當(dāng)檢測成分中含有N2H4時,分子內(nèi)的電荷可以與N2H4發(fā)生反應(yīng),所以會顯示熒光發(fā)射和紫外線吸收的光譜圖,進一步證明近紅外熒光探針DCMC能夠?qū)2H4檢測[3]。

    2.2.2 應(yīng)用于細胞中的檢測

    在進行細胞成像中,可以從實驗的進程里看出,在沒有加入時,熒光光譜圖未顯示有熒光發(fā)射,而在加入微量N2H4后,就會有熒光發(fā)射和紫外吸收的現(xiàn)象發(fā)生。如果繼續(xù)加大N2H4的劑量,熒光發(fā)射和紫外吸收的現(xiàn)象也會越明顯,這樣的實驗結(jié)果有利于后續(xù)對人類的生產(chǎn)生活產(chǎn)生持續(xù)的重要影響。所以探針DCMC在檢測中和細胞的兼容性很好,而且可以將活細胞中微量的檢測成分N2H4也能清晰地展現(xiàn)出來,說明近紅外熒光探針DCMC在生物活體上面做檢測不會損害細胞活性。

    2.3 近紅外熒光探針對苯硫酚檢測的應(yīng)用分析

    2.3.1 對苯硫酚檢測的應(yīng)用機理

    探針DCM-CHO-D對苯硫酚能夠進行檢測是因為探針DCM-CHO-D中是由2,4-二硝基苯磺酸酯負責(zé)識別信號、DCM-CHO-OH負責(zé)發(fā)出信號作為對苯硫酚進行檢測工作原理。探針DCM-CHO-D里DCM-CHO-OH信號基團被2,4-二硝基苯磺酸酯保護,做熒光檢測時被切斷了電荷的移動過程,所以熒光不會被發(fā)射;當(dāng)加入苯硫酚時,苯磺酸酯與苯硫酚發(fā)生反應(yīng)被水解,電荷可以進行轉(zhuǎn)移引起了熒光發(fā)射和紫外線吸收的變化[4]。

    2.3.2 應(yīng)用于細胞中的檢測

    在對活細胞的苯硫酚檢測中,對探針DCM-CHO-D進行細胞成像分析,發(fā)現(xiàn)加入苯硫酚之后熒光光譜顯示紅色熒光,未加之前細胞并未出現(xiàn)熒光。近紅外熒光探針DCM-CHO-D在苯硫酚檢測中細胞兼容性很好,說明探針DCM-CHO-D在生物活體上很友好,不會損害生物體細胞。

    綜上所述,以三類檢測物進行具體分析近紅外熒光探針的合成、表征及應(yīng)用。探針CyPd可以對鈀檢測做出快速反應(yīng),探針DCMC可以將微量的N2H4高靈敏的檢出,探針DCM-CHO-D能在保持細胞活性的基礎(chǔ)上檢測苯硫酚。未來近紅外熒光探針的發(fā)展還需要新時代的科研人才去繼續(xù)開發(fā)創(chuàng)造。

    參考文獻:

    [1]張逢源,劉曉燕,葉為春.一種近紅外熒光探針的合成、表征及應(yīng)用[J].分析測試技術(shù)與儀器,2019,25(04):228-231.

    [2]于雪,包青青,姜超.花菁類近紅外熒光探針在生物檢測中的應(yīng)用研究進展[J].化工進展,2019,38(12):5492-5503.

    [3]宋艷,黃文才,齊慶蓉.可用于肼檢測的新型近紅外熒光探針的合成及初步性能研究[J].華西藥學(xué)雜志,2019,34(04):325-331.

    [4]蘇偉.幾種近紅外熒光探針的合成表征及其實際應(yīng)用[D].湖南師范大學(xué),2017.

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