海水魚哈維氏弧菌、溶藻弧菌病二聯(lián)滅活疫苗對斜帶石斑魚和卵形鯧的注射、浸泡免疫研究

◆作者：鞏華 陳麗玲 賴迎迢 石存斌 孫承文 陶家發(fā)

◆單位：1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部漁藥創(chuàng)制重點實驗室，廣東省水產(chǎn)疫苗工程技術(shù)研究中心；2.陽江市水產(chǎn)技術(shù)推廣站

弧菌病是危害我國海水養(yǎng)殖魚類最常見的疾病，其中哈維氏弧菌、溶藻弧菌等是危害海水魚類主要的細菌性病原，經(jīng)常引起養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性死亡，嚴重時死亡率高達90%，成為制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸之一（鞏華等，2012；張燕飛等，2015；沈錦玉等，2010）。隨著人們對水產(chǎn)品質(zhì)量安全認識的提高，以抗生素等為代表的病害控制手段正在世界范圍內(nèi)逐漸被禁用和取締，作為符合環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的病害控制措施，以疫苗為代表的綠色防控品正成為國際海洋水養(yǎng)殖業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)規(guī)范和研究開發(fā)的前沿?zé)狳c領(lǐng)域。

近20 年來，美國、加拿大、日本和歐洲的許多國家不僅在實驗室做了小區(qū)域范圍內(nèi)的免疫接種實驗，而且已建立了工業(yè)化生產(chǎn)基地，虹彩病毒疫苗、IHN 基因工程疫苗、香魚假單胞菌疫苗以及多種弧菌疫苗等均已商品化。據(jù)不完全統(tǒng)計，截止到2017 年，全球商品化水產(chǎn)疫苗數(shù)量總計154 種（吳淑勤等，2014），其中有副溶血弧菌菌苗、殺鮭弧菌菌苗、鰻弧菌01 型和02 型二價菌苗、鰻弧菌- 殺鮭弧菌二聯(lián)菌苗、鰻弧菌- 海魚弧菌二聯(lián)菌苗、殺鮭氣單胞菌- 鰻弧菌- 殺鮭弧菌- 弧菌多聯(lián)菌苗等；除上述注射用疫苗外，還有浸泡型疫苗（如殺鮭氣單胞菌浸泡菌苗Aeromonas salmonicida immersion vaccine）和口服型疫苗（如AquaVacTMOral Vaccines）。

為加快我國弧菌疫苗研制進程，針對我國海水養(yǎng)殖魚類細菌性病害嚴重的現(xiàn)狀，我們對廣東、海南、福建等主要養(yǎng)殖海區(qū)致病性弧菌的流行菌株進行了分離、鑒定與特性分析，確定哈維氏弧菌和溶藻弧菌為我國南方地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類主要的致病性弧菌病原，獲得了流行代表性菌株，在進行了病原性分析和疫苗構(gòu)建之后，在陽江海水魚魚苗繁育場開展海水魚哈維氏弧菌、溶藻弧菌病二聯(lián)滅活疫苗浸泡免疫試驗檢測，現(xiàn)將主要試驗內(nèi)容和結(jié)果進行總結(jié)，以期為養(yǎng)殖中疫苗的申報和使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

哈維氏弧菌SpGY020601株：取自廣東省陽江市某海水養(yǎng)殖場患潰瘍病的卵形鯧肝臟；溶藻弧菌EpGS021001 株：取自廣東省深圳鹽田實驗基地養(yǎng)殖的患潰瘍病的斜帶石斑魚肝臟，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所分離、鑒定和保存。

1.2 試驗動物

1.3 動物感染試驗

采用腹腔注射法人工攻毒，菌液濃度分別為1.0×109、1.0×108、1.0×107和1.0×106CFU/mL，每組10 尾，每尾注射菌懸液0.1 mL，對照組注射等量滅菌鹽水（0.85%）。記錄實驗魚的癥狀和死亡情況，連續(xù)觀察7d。按Reed-Muench 法計算半致死劑量（LD50）。

1.4 疫苗制備

單價疫苗的制備：哈維氏弧菌SpGY020601 株和溶藻弧菌EpGS021001 株，分別用TSB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 后，5000RPM離心10min 收集菌體，0.85%的生理鹽水洗滌后制成菌懸液，0.5%(V/V) 的福爾馬林溶液4℃下滅活96h，經(jīng)無菌檢驗后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二聯(lián)疫苗的制備：用無菌生理鹽水分別稀釋上述溶藻弧菌和哈維氏弧菌單價疫苗到3×109CFU/mL，按1∶1（V/V）混合（分別含終濃度為1.5×109CFU/mL），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫原性測定

2 結(jié)果與分析

2.1 對試驗動物的毒性

哈維氏弧菌SpGY020601株的攻毒實驗中，高濃度組斜帶石斑魚經(jīng)腹腔注射后第2 日全部死亡，致死的斜帶石斑主要表現(xiàn)為無力側(cè)臥于水底，除胸鰭基部稍紅外，無其它明顯可見癥狀；1.0×108和1.0×107CFU/mL濃度組感染后第3 日，斜帶石斑開始表現(xiàn)無力側(cè)臥于底部，第5日部分魚出現(xiàn)尾鰭潰爛或體表潰瘍，與自然發(fā)病癥狀相似；1.0×106CFU/mL 濃度組除食欲降低外，基本正常；對照組注射無菌生理鹽水后正常。對卵形鯧的感染情況與斜帶石斑魚情況類似，急性死亡的魚不表現(xiàn)明顯癥狀，部分發(fā)病稍晚的注射部位出現(xiàn)潰爛。按Reed-Muench 法計算，哈維氏弧菌SpGY020601株對斜帶石斑的LD50為4.7×105CFU/g 體重，對卵形鯧的LD50為1.4×106CFU/g 體重。

人工注射溶藻弧菌EpGS 021001 株感染試驗表明，該菌株對斜帶石斑魚有明顯的致病作用，其結(jié)果見表1。1-3d 內(nèi)死亡魚無明顯癥狀，表現(xiàn)為側(cè)臥于池底，較分散，游泳能力減弱，攝食量減少；5d 后有明顯癥狀，注射部位潰爛，有黃色腹水。對照組不表現(xiàn)任何癥狀。再從經(jīng)人工感染發(fā)病的石斑魚肝臟分離出菌株，再次感染石斑魚，得到相同結(jié)果。對卵形鯧的感染情況與斜帶石斑類似，急性死亡的魚不表現(xiàn)明顯癥狀，部分發(fā)病稍晚的注射部位出現(xiàn)潰爛，死亡魚胸鰭基部變紅、腸道充血，并有少量腹水。按照Reed-Muench法計算，溶藻弧菌EpGS021001株對斜帶石斑魚的LD50為2.0×105CFU/g 體重，對卵形鯧的LD50為9.3×105CFU/g體重。

2.2 免疫保護原性

免疫接種后，人工攻毒的結(jié)果如表2-1、表2-2。免疫保護試驗結(jié)果顯示，注射免疫和浸泡免疫均有一定保護作用，可見構(gòu)建的疫苗效果較好。從統(tǒng)計結(jié)果來看，對于體重10g左右的魚苗，在注射免疫時，疫苗濃度在相當(dāng)于1.5×109CFU/mL 以上時，相對免疫保護率（RPS）可在80%以上；浸泡免疫時，疫苗的終濃度相當(dāng)于1.5×108CFU/mL 以上，相對免疫保護率（RPS）可達到55%以上。

從表中還可以看出，二聯(lián)苗注射組對哈維氏弧菌的RPS 可高達88.9%（優(yōu)于溶藻弧菌的85.7%），二聯(lián)苗浸泡實驗結(jié)果顯示6.0×106CFU/mL 以上也具有一定的免疫保護效果，其效果大體與濃度正相關(guān)。

表1 不同菌株對幾種魚類的人工感染試驗結(jié)果分析表

3 討論

弧菌病是危害海水養(yǎng)殖動物最嚴重的細菌性病害，未來集約化、工廠化養(yǎng)殖模式將成為海水養(yǎng)殖業(yè)主流的背景下，弧菌疫苗等海洋生物制品將成為病害控制不可替代的防控品。魚類是水生變溫動物，抗原的種類和性質(zhì)、抗原給予的途徑、劑量、佐劑、受免魚的規(guī)格及生理狀況，環(huán)境因子（如水溫等）等都會影響其免疫應(yīng)答，在研制魚類疫苗和制定免疫程序時均需考慮這些因素。

3.1 病原對魚類的敏感性不同

為控制弧菌病的爆發(fā)，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開展了大量流行病學(xué)的調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)弧菌病的分布區(qū)域幾乎為世界性的（鞏華等，2012；張燕飛等，2015；沈錦玉等，2010），其發(fā)生沒有宿主的種屬選擇性和地理上的差異，但在本實驗的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)不同魚對弧菌的耐受不同，還是有種屬之間差異，可能來自于不同物種間的受體不同（宋曉青等，2014；）。石斑魚對弧菌更敏感，是卵形鯧的3.0～4.7 倍。而溶藻弧菌的敏感性也要高于哈維氏弧菌的近兩倍。按照兩個因素分析，溶藻弧菌EpGS021001 株對石斑魚最敏感，其LD50為2.0×105CFU/g 體重，而浸泡免疫后，對溶藻弧菌的RPS 也最高，可能與溶藻弧菌的自然侵染方式有關(guān)。而哈維氏弧菌Sp-GY020601 株對卵形鯧的敏感性最小，其LD50為1.4×106CFU/g 體重，差別7 倍，且同樣濃度同種方式下，哈維氏弧菌疫苗對卵形鯧的保護也相對差。因此在選擇疫苗產(chǎn)品時，需要根據(jù)本地區(qū)的流行情況有針對性的選擇，不能一概而論。

3.2 多聯(lián)疫苗使用方便

隨著海水養(yǎng)殖的規(guī)?；图s化程度不斷提高，發(fā)現(xiàn)的海水養(yǎng)殖動物病原弧菌的種類也越來越多，迄今為止，作為病原菌分離報道的致病性弧菌己達數(shù)十種之多（宋曉青等，2014；張義兵等，2011；王慶等，2011）。由于病原對魚類的敏感性不同，針對不同病原需要構(gòu)建不同的疫苗，從使用上也存在著重復(fù)操作，浪費人力物力，還增加了魚類的應(yīng)激反應(yīng)。針對水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中多種病原的繼發(fā)、混合感染，2012 年挪威的三文魚疫苗已經(jīng)發(fā)展到對弧菌病、疥瘡病、腸炎等病害的六聯(lián)疫苗；美國默克公司到2012 年商業(yè)化魚類疫苗中多聯(lián)多價疫苗占30%（吳淑勤，2014）。本文用注射和浸泡免疫接種后，魚體均可得到免疫保護，可見本實驗所用疫苗構(gòu)建已經(jīng)達到預(yù)期。二聯(lián)苗注射免疫組的RPS 均可達80%以上，顯示良好的保護效果，產(chǎn)生了較強的免疫反應(yīng)，說明對斜帶石斑魚幼魚進行注射免疫是一條有效的免疫防治途徑。而同樣抗原情況下，浸泡免疫的RPS 也能達55%以上，顯示浸泡免疫有一定的保護作用，但有待于進一步加強。

表2 -1 不同菌株的免疫保護原性統(tǒng)計表

3.3 疫苗的接種途徑

目前商品化水產(chǎn)疫苗趨向?qū)嵱没?，全球商品化水產(chǎn)疫苗中，注射疫苗占66.7%，實用性高的浸泡、口服疫苗分別約占20%和13.3%（陳麗玲等，2019）。有許多因素影響浸泡免疫中抗原的攝取，如疫苗的濃度、浸泡時間的長短、魚的大小、佐劑的使用，抗原存在的物理狀態(tài)(顆粒狀或可溶性)、水溫等（任燕等，2018）。在這些因素中抗原的濃度和浸泡時間的長短對于抗原的攝取和保護作用是最重要的。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，其浸泡濃度有一定的下限，即低于某一濃度后，就不再發(fā)生免疫保護，如本實驗中二聯(lián)苗浸泡實驗結(jié)果顯示6.0×106CFU/mL 以上也具有一定的免疫保護效果，其效果還是大體與濃度正相關(guān)。當(dāng)然，疫苗濃度和浸泡時間的相互關(guān)系是很復(fù)雜的，并且受到抗原類型的影響需要做進一步深入研究。養(yǎng)殖魚在自然條件下的病原菌感染過程不會象人工注射感染那么高的死亡率，浸泡免疫也不會對魚體造成傷害、操作方便(陳麗玲等，2019)，因此，在實際生產(chǎn)中浸泡免疫也是一條有效的防治途徑，特別在大規(guī)模養(yǎng)殖中，具有良好的應(yīng)用前景，需要進一步加強研究開發(fā)。

表2 -2 不同菌株的免疫保護原性統(tǒng)計表