煙草祖先種及重要野生種PDR1基因的生物信息學(xué)分析

平文麗，李雪君，孫計(jì)平，孫煥

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲(chóng)害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南許昌 461000

植物的多向耐藥性（Pleiotropic drug resistance，PDR）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的G亞家族蛋白[1]。ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于原核、真核生物的細(xì)胞膜系統(tǒng)中，參與多種初生代謝物、次生代謝物的跨膜運(yùn)輸，但PDR所屬的亞家族只存在于植物與真菌中。植物的PDR蛋白廣泛參與到營(yíng)養(yǎng)吸收、發(fā)育調(diào)控、解毒過(guò)程以及植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的防御反應(yīng)中[2,3]。近年來(lái)，針對(duì)模式植物擬南芥和主要作物的研究還表明，PDR是多抗基因，與多種植物對(duì)真菌病原的抗性相關(guān)，例如，AtPDR12參與擬南芥對(duì)真菌病害的抗性[4-5]；水稻中的OsPDR9[6]及大豆中的GmPDR12均具有抗真菌的作用[7]。從小麥中分離到與鐮刀菌抗性相關(guān)的兩個(gè)PDR類基因TaPDR1和TaPDR7，能通過(guò)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)途徑及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)由鐮刀菌產(chǎn)生的代謝毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON毒素）等方式，減輕病菌對(duì)小麥的毒害[8-10]。在煙草研究中，目前已經(jīng)證實(shí)漸窄葉煙草（Nicotiana attenuata）中的NaPDR1和NaPDR1-like基因?qū)φ婢惒≡湼矜呔ˋlternaria alternata）的抗性至關(guān)重要[11]；普通煙草中的NtPDR1基因參與煙草對(duì)病原的抗性反應(yīng)中[12]；藍(lán)茉莉葉煙草（Nicotiana plumbaginifolia）中ABC家族的NpABC1基因參與次生代謝物萜類物質(zhì)的分泌，所以與真菌抗病性相關(guān)[13]，但關(guān)于普通煙草PDR基因與真菌病害抗性的關(guān)系尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

煙草鐮刀菌根腐病是由鐮刀菌引起的一種真菌性病害，會(huì)導(dǎo)致煙草品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低、煙草生產(chǎn)產(chǎn)值降低。近年來(lái)該病害在我國(guó)河南、湖南、福建等各大煙區(qū)均有發(fā)生，且發(fā)生情況呈上升趨勢(shì)[14]。防治該病害危害最經(jīng)濟(jì)有效的手段是選育抗病品種，但是目前普通煙草中關(guān)于抗鐮刀菌根腐病的種質(zhì)資源、相關(guān)抗病基因的報(bào)道較少、已知具有抗鐮刀菌根腐病的煙草種質(zhì)資源較少，抗病育種工作有賴于挖掘栽培煙草祖先種、野生近緣種中所蘊(yùn)含的抗病基因。普通煙草（Nicotiana tabacum）基因組（SSTT）中S基組及T基組分別來(lái)源于祖先種林煙草（S）、絨毛狀煙草（T）。野生資源是指除了兩個(gè)栽培種（普通煙草、黃花煙）之外的所有煙草屬的植物種[15]。這些植物種是在長(zhǎng)期的自然選擇條件下保留下來(lái)的類型，其中某些重要的野生種中蘊(yùn)含著豐富的抗病基因，是煙草育種工作中抗病基因主要來(lái)源。如黏煙草（N.glutinosa）是白粉病和普通花葉病的重要抗源，長(zhǎng)花煙草（N.longiflora）和藍(lán)茉莉葉煙草（N.plumbaginifolia）是黑脛病的重要抗源[15-16]；但是對(duì)煙草鐮刀菌根腐病的抗源、抗病基因的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。前人的研究表明，PDR基因具有廣譜抗病性，且與小麥等植物對(duì)鐮刀菌屬病原的抗性相關(guān)，基于此，本文從相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取煙草及其祖先種和重要近緣野生種的PDR基因和蛋白序列，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能等特征進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，以期為后續(xù)的基因功能研究、基因編輯、抗病分子育種等工作提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇的研究對(duì)象包括：普通煙草（Nicotiana tabacum）、煙草的祖先種林煙草（Nicotiana sylvestris）和絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）、重要野生煙草本氏煙（Nicotiana benthamiana）、藍(lán)茉莉葉煙草（Nicotiana plumbaginifolia）、漸窄葉煙草（Nicotiana attenuata）等的DNA和蛋白序列。

1.2 方法

依據(jù)模式植物擬南芥中與抗真菌相關(guān)的AtPDR12基因的蛋白、普通煙草NtPDR1基因序列，通過(guò)BLAST比對(duì)等方式，從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（https://www.arabidopsis.org/）[17]、NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、本氏煙數(shù)據(jù)庫(kù)Benthgenome（http://benthgenome.qut.edu.au/）[18-19]、 茄 科 植 物 數(shù)據(jù) 庫(kù) solgenomics（https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_attenuata/genome）[20]等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢煙草祖先種及重要近緣野生種的PDR1基因；通過(guò)ExPASy網(wǎng)站的翻譯工具（Translate，https://web.expasy.org/translate/）翻譯為PDR1蛋白序列、采用蛋白參數(shù)分析工具（ProtParam，https://web.expasy.org/protparam/，以及 protscale：https://web.expasy.org/protscale/）分析這些基因的理化特性；用TMHMMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、pepwheel（http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel）、phyre2（www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre） 等工具預(yù)測(cè)其跨膜結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)；用SUBA4（http://suba.live/）[21]在線分析相關(guān)蛋白在細(xì)胞中的定位；用比較基因組學(xué)工具CoGe Blast（https://genomevolution.org/coge/CoGeBlast.pl#）分析普通煙草各條染色體上PDR1基因的高度相似的序列；用BDGP（https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）分析基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 和 PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）等工具預(yù)測(cè)NbPDR1基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件，進(jìn)而進(jìn)行功能預(yù)測(cè)；最后，用 CRISPRdirect（https://crispr.dbcls.jp）[22]在 線 工 具預(yù)測(cè)了NtPDR1基因的基因編輯位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通煙草、煙草祖先種、重要近緣野生種中PDR1蛋白的理化特征

以AtPDR12序列為探針，通過(guò)序列比對(duì)（TBLASTN和BLASTP等）從各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取煙草、祖先種及近緣野生種的PDR基因如下：普通煙草中有5個(gè)相似序列：NtPDR1，NtPDR2，NtPDR3，NtPDR4及NtPDR5；林煙草、絨毛狀煙草、本氏煙、漸窄葉煙草中均有3個(gè)相似序列：PDR1、PDR2和PDR3；藍(lán)茉莉葉煙草中有3個(gè)相似序列PDR1，PDR2和PDR5。在其他已測(cè)序的野生煙草，如黏煙草（Nicotiana glutinosa，絨毛煙草組，2n=24）、福爾吉特氏煙草（Nicotiana forgetiana，花煙草組，2n=18）、花煙草（Nicotiana alata，花煙草組，2n=18）、淺波煙草（Nicotiana repanda，淺波煙草組，2n=48）的基因組中未搜到相似序列。綜合文獻(xiàn)資料中煙草屬的分類信息，黏煙草和普通煙草分別屬于普通煙亞屬的不同組別；福爾吉特氏煙草、花煙草、淺波煙草均屬于碧冬煙亞屬的花煙草或淺波煙草組，和普通煙草分別屬于不同的亞屬。推測(cè)這些煙草屬植物雖然具有相同的祖先，但在進(jìn)化過(guò)程中染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)發(fā)生了變異，導(dǎo)致這些物種中某些基因結(jié)構(gòu)與普通煙草有較大差別或發(fā)生了基因丟失。

對(duì)所得序列按照得分（Score）高、比對(duì)覆蓋度（query coverage）高、與AtPDR12序列一致程度（Percent identity）高（高于60%）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到的均為PDR1基因，所以本文選擇各物種中的PDR1基因、蛋白作為研究對(duì)象。

利用ExPASY網(wǎng)站上的工具軟件對(duì)普通煙草、祖先種及其重要近緣野生種的PDR蛋白的氨基酸序列及其理化特性進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明，幾個(gè)不同煙草的PDR1蛋白的分子量均與擬南芥相類似，為161-162 kD；組成該蛋白的氨基酸數(shù)為1432-1436個(gè)，其中組成跨膜區(qū)的氨基酸數(shù)為289-293個(gè)，略多于擬南芥；煙草中PDR1蛋白的等電點(diǎn)為6.3-6.56，比擬南芥ATPDR12的等電點(diǎn)低；蛋白的半衰期為30小時(shí)，不穩(wěn)定指數(shù)介于33.07至35.81之間，是在植物中穩(wěn)定存在的蛋白。各蛋白的分子式及其具體特征參數(shù)如表1所示。

表1 煙草及其祖先種、主要近緣野生種中PDR1蛋白的特征參數(shù)Tab.1 Characteristic parameters of PDR1 in tobacco and its ancestral species and major wild species

2.2 PDR1蛋白氨基酸序列的比對(duì)及結(jié)構(gòu)域分析

針對(duì)模式植物擬南芥中AtPDR12基因及其編碼的蛋白研究表明，PDR編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），該基因在擬南芥的葉、花、氣孔、根等組織中均有表達(dá)，編碼的蛋白包含跨膜結(jié)構(gòu)域及核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其亞細(xì)胞定位為細(xì)胞質(zhì)膜上（SUBA data）[21]。序列比對(duì)結(jié)果表明，煙草祖先種、多種近緣野生種均存在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守功能域NBD和TMD，功能域之間靠疏水結(jié)構(gòu)連接，各個(gè)模序（motif）序列（包括Walker A、Q-loop、ABC標(biāo) 簽、Pro-loop、Walker B、D-loop、H-loop等）與擬南芥等物種中PDR序列及排列順序完全一致[23]，暗示煙草中PDR蛋白完全符合PDR蛋白的特征、該蛋白的結(jié)構(gòu)域與其功能密切相關(guān)，在進(jìn)化過(guò)程中非常保守、無(wú)任何突變。具體結(jié)構(gòu)域及序列如圖1所示。

圖1 煙草及其祖先種、主要近緣野生種中PDR1蛋白序列比對(duì)及在進(jìn)化中保守的蛋白結(jié)構(gòu)域（其中方框?yàn)锳TP結(jié)合區(qū)域里的幾個(gè)motif）Fig.1 Sequence alignment of PDR1 proteins in tobacco and its ancestral species, major wild species and conserved protein domains in evolution, where the boxes indicate motifs in the ATP binding area

根據(jù)在線工具TMHMM的分析，本文研究的普通煙草、煙草祖先種及重要近緣野生種中所有的PDR1蛋白均由2個(gè)核酸結(jié)合區(qū)（nucleotide-binding domains，NBD）和2個(gè)分別由6-7個(gè)跨膜α螺旋（membrane spanning alpha helices）構(gòu)成的跨膜區(qū)（Transmembrane domain， TMD）組成。從N端到C端，依此為NBD1，TMD1，NBD2和TMD2。其中NBD1位于蛋白的N端，NBD2位于蛋白的中部，跨膜區(qū)TMD1和TMD2位于蛋白的中部和C端，見(jiàn)圖2。該特征與擬南芥等其他物種中PDR蛋白的結(jié)構(gòu)域特征也完全相符[23]。

本研究運(yùn)用在線工具pepwheel對(duì)幾種煙草PDR1蛋白的NBD和TMD之間的氨基酸序列進(jìn)行了分析，得出的輪狀圖見(jiàn)圖3。結(jié)果表明：在該區(qū)域中由疏水氨基酸和親水氨基酸組成了螺旋狀的疏水結(jié)構(gòu)，符合ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特征。

2.3 NtPDR1蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

綜合Expasy網(wǎng)站提供的在線工具phyre2等蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)工具的預(yù)測(cè)結(jié)果，以普通煙草的NtPDR1為例，本文分析了普通煙草NtPDR1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該蛋白包含了14個(gè)嵌入細(xì)胞膜的區(qū)段，N端和C端則在膜外側(cè)。左側(cè)的7個(gè)螺旋狀結(jié)構(gòu)域組成核酸結(jié)構(gòu)域NBD；右側(cè)的α螺旋組成跨膜區(qū)TMD。兩者之間靠氨基酸的疏水作用連接，三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖4所示。

2.4 比較基因組學(xué)分析

采用CoGe Blast分析普通煙草基因組各條染色體上PDR1基因的相似序列。結(jié)果如圖5所示。在煙草的第9、13、14、15及23條染色體上，均有與PDR1基因高度相似的序列，CoGe BLAST結(jié)果顯示，這五條染色體上相似序列的E值分別為4e-170，3e-117，0，0，2e-100，根據(jù)生物信息學(xué)原則，E值小于10-6即視為序列高度相似，因而推測(cè)這些染色體上均有與PDR1同源的序列；其中第14、15條染色體上的序列的E值等于0，相似度最高，推測(cè)PDR1基因即位于第14、15號(hào)染色體上。其他幾個(gè)染色體上的序列有高達(dá)70%的部分與NtPDR1完全一致。該結(jié)果暗示PDR基因在生長(zhǎng)發(fā)育或應(yīng)對(duì)脅迫中有重要作用，因而在基因組里有冗余。

圖2 煙草及祖先種、重要野生種中PDR1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of PDR1 protein in tobacco, its ancestral and important wild species

圖3 煙草祖先種及重要野生種的PDR1蛋白中NBD與TMD之間的疏水氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of hydrophobic amino acid structure between NBD and TMD domain of PDR1 in tobacco, its ancestors and important wild species

2.5 啟動(dòng)子的順式作用元件預(yù)測(cè)

植物基因組中與抗病、抗逆相關(guān)基因一般僅在特定的情況下表達(dá)，以避免給植物正常生長(zhǎng)帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)[24]。其表達(dá)調(diào)控主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件的結(jié)合，啟動(dòng)、增強(qiáng)或者抑制基因的表達(dá)，從而調(diào)控下游基因表達(dá)、抵御外界脅迫。本文從數(shù)據(jù)庫(kù)中提取NbPDR1基因上游的3000bp的DNA序列，利用BDGP分析該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，結(jié)果表明，只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，啟動(dòng)子所在位置為554-604 bp處。其啟動(dòng)子序列為：CA AACTATTATATATAGAGAGAGGTGACAAAGAAAA AAGGAAAAGAGTGT。

圖4 NtPDR1蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu)。圖中顏色為彩虹色，從紅到藍(lán)紫色指示蛋白從N端到C端的氨基酸結(jié)構(gòu)Fig.4 The tertiary structure model of NBD and TMD of NtPDR1 in Nicotiana tabacum.The amino acid structure of the indicator protein from the N-terminal to the C-terminal ranges from red to blue-purple

圖5 普通煙草基因組上與NtPDR1高度相似片段的定位Fig.5 Locations of highly similar fragments of NtPDR1 on the tobacco (Nicotiana tabacum) genome

用Plant Care和PLACE預(yù)測(cè)了NbPDR1的啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。綜合對(duì)比對(duì)其結(jié)果，得出的順式作用元件如表2所示。對(duì)順式作用元件進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論：NbPDR1基因啟動(dòng)子的調(diào)控元件主要包括4類：1）組成型元件，如31個(gè)TATA-box、39個(gè)CAAT-box等；2）病原菌誘導(dǎo)、與抗病相關(guān)的響應(yīng)元件，其中包括1個(gè)真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件ELRECOREPCRP1、3個(gè)抗真菌病害相關(guān)的元件BIHD1OS、以及其他多個(gè)病原真菌響應(yīng)相關(guān)的元件；其中，啟動(dòng)子區(qū)還有一個(gè)DON毒素誘導(dǎo)表達(dá)的特異元件-300ELEMENT，表明該基因受到鐮刀菌的誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，暗示該基因可能參與DON毒素的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒相關(guān)、能夠減輕鐮刀菌及其毒素對(duì)煙草的毒害，與煙草耐DON毒素、對(duì)鐮刀菌引起的病害的抗性相關(guān)。3）大量與植物抗病防御中起到關(guān)鍵作用的激素的應(yīng)答等相關(guān)的元件，其中包括35個(gè)與水楊酸（SA）誘導(dǎo)相關(guān)的元件GT1CONSENSUS、32個(gè)與脫落酸（ABA）干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件MYCCONSENSUSAT、1個(gè)與茉莉酸（JA）響應(yīng)相關(guān)的元件CGTCA-motif；4）其他，包括1個(gè)鈣離子響應(yīng)元件ABRERATCAL。

表2 NbPDR1啟動(dòng)子的順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Prediction of cis-acting elements in promoter regions of NbPDR1 in Nicotiana benthamiana

2.6 基因編輯位點(diǎn)分析

采用在線gRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站CRISPR direct，以NGG為PAM序列，設(shè)計(jì)針對(duì)普通煙草NtPDR1的基因編輯靶位點(diǎn)。得到的CRISPR/Cas9基因編輯的靶位點(diǎn)中，得分最高、脫靶概率最低的4個(gè)基因編輯位點(diǎn)信息如表3所示。這四個(gè)靶位點(diǎn)中，兩個(gè)位于負(fù)義鏈（-），兩個(gè)位于正義鏈（+），序列的GC含量適中，20 bp全長(zhǎng)序列和PAM及12 bp種子序列和PAM的靶位點(diǎn)在整個(gè)基因組范圍內(nèi)都只有1個(gè)，脫靶概率較低，表明，該基因存在至少4個(gè)適用于基因編輯的靶位點(diǎn)。

表3 CRISPR/Cas9基因編輯靶位點(diǎn)Tab.3 Target site of CRISPR/Cas9 gene editing

3 討論和結(jié)論

PDR蛋白是植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G亞家族的成員，在多種植物中的研究結(jié)果表明，PDR蛋白參與植物對(duì)多種生物脅迫及非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程[1-7]。目前在普通煙草中已經(jīng)報(bào)道的NtPDR1參與次生代謝物如二萜、倍半萜烯萜等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及葉面的環(huán)二萜類等物質(zhì)的分泌，調(diào)節(jié)煙草對(duì)生物脅迫及非生物脅迫的抗性[12]。漸窄葉煙草NaPDR1和NaPDR1-like基因與真菌類病害抗性相關(guān)[11]；近年來(lái)，在煙草BY2懸浮細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NtPDR1既參與煙草的組成型抗性，也參與煙草的誘導(dǎo)抗性[3]。

本文利用擬南芥和普通煙草中PDR基因、蛋白序列為基礎(chǔ)，獲取并分析了普通煙草、煙草祖先種及近緣野生種的PDR1基因、蛋白序列及結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果表明這些序列之間均存在高度相似性、蛋白的結(jié)構(gòu)均含有核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域NBD和跨膜結(jié)構(gòu)域TMD，且包含了所有保守基序，符合經(jīng)典的PDR結(jié)構(gòu)特征。

此外，NtPDR1基因的重要同源基因NbPDR1基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件包括DON毒素誘導(dǎo)的特異啟動(dòng)子，暗示該基因的表達(dá)受到鐮刀菌的正向誘導(dǎo)、可能與煙草對(duì)鐮刀菌的抗性相關(guān)；也包含大量病原菌誘導(dǎo)、病原真菌誘導(dǎo)響應(yīng)等大量抗病響應(yīng)相關(guān)的元件，表明該基因的表達(dá)受到病原菌、真菌脅迫、多種逆境脅迫的誘導(dǎo)；該基因上游還有大量與ABA、SA、JA等多種激素響應(yīng)相關(guān)的元件，這些激素均參與調(diào)控植物抗性，暗示PDR基因在植物抗病反應(yīng)中的表達(dá)水平會(huì)受到激素誘導(dǎo)的影響。另外，從調(diào)控元件預(yù)測(cè)結(jié)果推斷，NbPDR1基因還參與植物的耐旱、耐鹽、機(jī)械損傷、鈣離子響應(yīng)等多種生理過(guò)程，暗示煙草的PDR1基因除了對(duì)真菌病害具有抗性外，還能夠響應(yīng)多種脅迫因素或者受脅迫相關(guān)的激素的誘導(dǎo)表達(dá)、防御逆境，表明該基因可能參與煙草對(duì)包括鐮刀菌病原在內(nèi)的多種生物、非生物脅迫的響應(yīng)，是一個(gè)廣譜抗性相關(guān)基因，在分子育種、抗病育種等工作中有較好的應(yīng)用潛力。