依達(dá)拉奉對(duì)小鼠肺型氧中毒的保護(hù)作用及其機(jī)制*

包曉辰, 方以群, 馬 駿, 王芳芳

(海軍特色醫(yī)學(xué)中心潛水醫(yī)學(xué)研究室，上海 200433)

氧氣是維持生命的必要條件，被廣泛應(yīng)用于潛水作業(yè)、高壓氧治療及呼吸機(jī)輔助支持治療中。如常壓氧氣常被用來治療各種缺氧性疾病，高壓氧氣(氧氣絕對(duì)壓大于1.0 ATA)被用來治療減壓病、股骨頭壞死等疾病。但長(zhǎng)時(shí)間暴露于氧氣中會(huì)導(dǎo)致氧中毒的發(fā)生。肺組織是直接接觸氧氣的部位，有大量的對(duì)氧毒性敏感的上皮細(xì)胞，從而成為氧中毒的主要靶器官之一，導(dǎo)致肺型氧中毒的發(fā)生[1-3]。目前對(duì)于肺型氧中毒尚無有效的治療方法。

依達(dá)拉奉是一種神經(jīng)元保護(hù)劑，臨床上主要用于治療缺血性腦血管疾病。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可通過清除羥自由基、提高體內(nèi)抗氧化酶活性、減輕炎癥反應(yīng)及降低細(xì)胞凋亡等對(duì)膿毒癥、百草枯等導(dǎo)致的急性肺損傷起到保護(hù)作用[4]。炎癥及凋亡是肺型氧中毒的主要發(fā)病機(jī)制，本文擬在高壓氧致肺型氧中毒的小鼠模型中探討依達(dá)拉奉的預(yù)防作用及干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

30只雄性C57BL/6小鼠，體重(29.81+0.49)g，購(gòu)買于上海畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。實(shí)驗(yàn)前1周飼養(yǎng)于海軍醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心。動(dòng)物分為3組(n=10)：空氣對(duì)照組;高壓氧暴露組，暴露在2.5 ATA，≥95%氧氣中6 h; 高壓氧依達(dá)拉奉干預(yù)組(高壓氧+依達(dá)拉奉)。依達(dá)拉奉溶于無菌水，5 mg/kg，腹腔注射。每日1次，連用3 d。高壓氧暴露組及空氣對(duì)照組腹腔注射等量滅菌水作為對(duì)照。

1.2 試劑

兔抗鼠的cleaved-caspase-3、total caspase-3抗體、蛋白裂解液及二抗抗體購(gòu)自美國(guó)cell signial公司，蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)thermo公司，兔抗鼠的Actin抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司。IL-6、IL-1β的ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。超氧化物酶岐化物(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒購(gòu)自美國(guó) R&D 公司。

1.3 高壓氧暴露方案

高壓氧暴露組及高壓氧依達(dá)拉奉干預(yù)組動(dòng)物置于氧艙內(nèi)，氧艙內(nèi)放置二氧化碳吸收劑(碳酸鈣)。100%氧氣洗艙10 min后，緩慢加壓至0.23 MPa，共暴露6 h。保持小流量(5 L/min)純氧持續(xù)通氣，將艙室CO2濃度保持在<300 ml/m3。期間連續(xù)監(jiān)測(cè)氧氣含量，并保持氧氣含量≥95%。暴露結(jié)束后，5 min內(nèi)勻速減壓出艙。空氣暴露組小鼠置于氧艙內(nèi)呼吸常壓空氣6 h。

1.4 組織病理分析

小鼠出艙后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取右上肺葉4%多聚甲醛固定，后置20%蔗糖溶液(4℃)中過夜。石蠟包埋，切片，貼片。一部分切片采用蘇木精及伊紅染色后，行常規(guī)病理分析。

1.5 肺組織濕干比測(cè)定

取右下肺組織，稱取各個(gè)肺組織的濕重后，置于80℃烤箱中烘烤48 h后，稱取干重，計(jì)算濕/干重的比例。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子

取左肺組織，在蛋白裂解液中裂解后，1 000× g，4℃離心10 min，取上清液，測(cè)定蛋白含量。按照試劑盒說明，檢測(cè)IL-6及IL-1β在肺組織中的含量。

1.7 抗氧化酶含量檢測(cè)

取上述肺組織裂解液上清，按照試劑盒說明，加入反應(yīng)體系中，裂解液中的抗氧化酶和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB，通過每隔30 s，共5 min測(cè)定550 nm處的吸光度，檢測(cè)黃色底物TNB的生成量，按照公式計(jì)算肺組織中抗氧化酶GSH及SOD的含量。

1.8 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白

取上述肺組織裂解蛋白，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，等量樣品加入電泳槽中，濃縮膠90 V電泳15 min，10%分離膠120 V電泳90 min后。400 mA恒流轉(zhuǎn)膜150 min，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別與一抗cleaved-caspase-3、total caspase-3(1∶1 000)，Actin(1∶8 000)4℃孵育過夜。TBST洗脫15 min×3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST洗脫15 min×3次，ECL液顯影，膠片曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)高壓氧導(dǎo)致的肺損傷的影響

病理組織分析結(jié)果：高壓氧暴露組的肺組織呈現(xiàn)明顯的肺泡壁增厚、組織出血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等肺型氧中毒的病理特征。依達(dá)拉奉可明顯減輕這些病理特征(圖1)。和空氣對(duì)照組相比較，高壓氧暴露后肺組織濕/干比明顯上升(4.81±0.25vs4.47±0.11，P<0.01，n=9)，提示肺水腫的存在，而依達(dá)拉奉預(yù)防性應(yīng)用可顯著降低高壓氧導(dǎo)致的肺水腫,依達(dá)拉奉組肺濕/干比和空氣對(duì)照組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(4.62±0.16vs4.47±0.11，n=9，P>0.05，圖1)。

Fig. 1 Effects of edaravone on pulmonary oxygen toxicity as determined by histological analysis(HE ×200)and wet/dry(W/D)lung weight ratio(n=9)

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

**P<0.01vsAir + vehicle group

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)高壓氧導(dǎo)致的肺組織炎性因子表達(dá)的影響

和空氣對(duì)照組比較，高壓氧暴露組小鼠肺組織中IL-1β的含量顯著升高(P<0.01，n=9)，而依達(dá)拉奉干預(yù)組的IL-1β的含量和高壓氧暴露組相比明顯降低(P<0.01，n=9)。IL-6的含量在各組小鼠肺組織中無明顯改變，三組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，n=9，表1)。

GroupIL-1βIL-6Air+Vehicle532.28±127.23??129.57±32.82HBO+Vehicle735.06±122.61115.44±38.74HBO+YD521.14±113.23??120.73±41.44

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

**P<0.01vsHBO + vehicle group

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)抗氧化酶活性的影響

和空氣對(duì)照組相比，GSH在高壓氧暴露組及依達(dá)拉奉干預(yù)組中都顯著下降(P<0.05，n=9)，而高壓氧暴露組和依達(dá)拉奉干預(yù)組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，n=9)。與空氣對(duì)照組相比，SOD的表達(dá)量在高壓氧暴露組及依達(dá)拉奉干預(yù)組中顯示下調(diào)趨勢(shì)，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，n=9，表2)。

GroupGSHSODAir+Vehicle25.11±6.5322.84±6.82HBO+Vehicle18.47±1.71?19.67±4.40HBO+YD16.58±2.58??25.11±6.53

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

*P<0.05，**P<0.01vsAir + vehicle group

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)高壓氧導(dǎo)致的肺組織細(xì)胞的凋亡的影響

和空氣對(duì)照組比較，高壓氧暴露組小鼠肺組織的凋亡蛋白cleaved-caspase3表達(dá)明顯升高(P< 0.05，n=5)，而依達(dá)拉奉干預(yù)組的cleaved-caspase3的值和高壓氧暴露組相比明顯降低(P<0.05，n=5，圖2)。

Fig. 2 Effects of edaravone on the expression levels of cleaved caspase-3, caspase-3 proteins(n=5)

HBO: Hyperbaric oxygen; YD: Edaravone

*P<0.05vsHBO + vehicle group

3 討論

持續(xù)暴露于高壓氧環(huán)境下可產(chǎn)生氧自由基。氧自由基可導(dǎo)致顯著的肺損傷，如肺泡滲透性增加，肺水腫，細(xì)胞凋亡及炎癥因子的上調(diào)[5, 6]。目前針對(duì)肺型氧中毒沒有有效的治療方法。依達(dá)拉奉是一種神經(jīng)元保護(hù)劑，臨床上主要用于治療缺血性腦血管疾病。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可通過清除羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化，抑制白三烯的生成，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[7]。研究證實(shí)依達(dá)拉奉對(duì)急性肺損傷也具有保護(hù)作用，如可通過升高抗氧化酶活性、減少致炎性因子分泌對(duì)百草枯中毒導(dǎo)致的肺損傷起到保護(hù)作用[8]；可通過減少氧自由基產(chǎn)生、降低NF-κB信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)降低膿毒癥導(dǎo)致的肺損傷[9]。

本研究結(jié)果首次探討了依達(dá)拉奉在肺型氧中毒中的保護(hù)作用。結(jié)果顯示依達(dá)拉奉預(yù)防性使用可有效降低肺型氧中毒小鼠肺組織的損傷及高滲透性，同時(shí)抑制炎癥因子及細(xì)胞凋亡蛋白。炎癥是氧中毒導(dǎo)致肺損傷的重要表現(xiàn)之一。體內(nèi)富集的氧自由基可影響細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，增加前致炎性因子IL-1β、IL-6等的分泌[10]。本研究結(jié)果顯示依達(dá)拉奉可有效逆轉(zhuǎn)肺型氧中毒導(dǎo)致的IL-1β的升高。

凋亡是肺型氧中毒的另一重要表現(xiàn)[11]。tunel染色及cleaved-caspase-3表達(dá)水平增加提示肺型氧中毒時(shí)肺泡上皮細(xì)胞可發(fā)生凋亡。而caspase-3基因敲除小鼠在常壓氧中暴露72 h后，肺上皮細(xì)胞凋亡比率明顯比野生型小鼠增大[12]。這提示caspase-3基因激活在肺型氧中毒導(dǎo)致的肺上皮細(xì)胞死亡中起著重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中我們檢測(cè)了各組小鼠肺組織中cleaved-caspase-3的表達(dá)變化。結(jié)果顯示相對(duì)于常壓氧對(duì)照組大鼠，高壓氧暴露組肺組織中cleaved-caspase-3表達(dá)量明顯增高，提示出現(xiàn)肺組織細(xì)胞凋亡，而依達(dá)拉奉的預(yù)防性使用可顯著降低cleaved-caspase-3表達(dá)量，提示依達(dá)拉奉對(duì)肺型氧中毒的肺組織細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

抗氧化酶是體內(nèi)代謝氧自由基的主要途徑，抗氧化酶活性的增高可有效降低氧自由基造成的損傷[13]。但在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示高壓氧暴露后GSH及SOD的含量和空氣對(duì)照組相比有明顯的下降趨勢(shì)，而依達(dá)拉奉預(yù)防性使用對(duì)GSH及SOD的活性無明顯影響。我們分析認(rèn)為，首先高壓氧暴露組抗氧化酶活性的降低，是由于體內(nèi)的抗氧化酶過多的消耗導(dǎo)致，而依達(dá)拉奉組對(duì)抗氧化酶活性無影響，提示升高抗氧化酶活性不是依達(dá)拉奉在肺型氧中毒中的保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，預(yù)防性使用依達(dá)拉奉可通過降低炎性因子分泌及減少細(xì)胞凋亡對(duì)肺型氧中毒起到保護(hù)作用。