益氣化濕通絡(luò)方對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎功能衰竭大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷及纖維化的改善作用*

朱曉婷，陳志強(qiáng)

(1.河北中醫(yī)學(xué)院 石家莊 050200；2.河北省中醫(yī)院，石家莊 050200；3.唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000)

腎臟纖維化是慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)的病理改變，是腎小球、腎間質(zhì)在損傷情況下的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。隨著纖維化的進(jìn)展，腎功能逐漸喪失至衰竭，而發(fā)展成為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)[1]。研究證實(shí)[2]，CRF患者存在促氧化狀態(tài)(pro-oxidant state)，氧化應(yīng)激在病情進(jìn)展，加重纖維化進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。Hoffman[3]等發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腎病患者存在線粒體功能障礙，隨之產(chǎn)生氧化應(yīng)激，致組織損傷，進(jìn)展為CRF。氧化應(yīng)激還可引起TGF-β1的表達(dá)增加[4]，而TGF-β1蛋白是一種可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)Ι型和Ⅲ型膠原分泌而增加細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成，引起腎小球硬化的促纖維化因子。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路[5]是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，具有潛在的抗氧化治療的臨床研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)將探討Nrf2/Keap1信號(hào)通路、TGF-β1蛋白與CRF氧化應(yīng)激、纖維化進(jìn)程的關(guān)系及可能的分子機(jī)制。

目前關(guān)于CRF患者的臨床治療方法，診療指南指出[6]：聯(lián)合用藥及飲食控制。在CRF早、中期主要是保守治療及針對(duì)并發(fā)癥的治療等，當(dāng)發(fā)展到GFR﹤15 ml/(min·1.73 m2)時(shí)，應(yīng)實(shí)施透析及腎移植等腎臟替代治療。但臨床療效并不理想。YHT是根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)擬定的經(jīng)驗(yàn)方，能夠有效改善CRF患者癥狀并延緩其進(jìn)入透析及腎移植等晚期階段的進(jìn)程[7]。本研究采用5/6腎切除大鼠創(chuàng)建的CRF模型，是考慮臨床患者腎衰發(fā)生發(fā)展的整個(gè)病理進(jìn)程與此模型造成的腎功能損傷、病理形態(tài)學(xué)改變具有高度相似性[8]，對(duì)此模型的干預(yù)具有臨床針對(duì)性和實(shí)際意義。YHT對(duì)此腎衰大鼠模型的殘存腎臟功能損傷的改善作用及對(duì)腎臟纖維化的治療作用的機(jī)制探討，為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療CRF及其并發(fā)癥提供了進(jìn)一步可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

益氣化濕通絡(luò)方：黃芪25 g、當(dāng)歸12 g、川芎10 g、紅花10 g、地龍10 g、水蛭3 g、仙茅10 g、仙靈脾12 g、藿香6 g、佩蘭6 g、陳皮12 g、白豆蔻6 g、土茯苓30 g、積雪草30 g組成。中藥顆粒劑(廣東一方制藥有限公司)；鹽酸貝那普利片(商品名:洛丁新，購(gòu)于北京諾華制藥有限公司)；HE試劑盒和SOD、MDA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；BCA法蛋白定量試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；Keap1、Nrf2、NOX4、TGF-β1、collagenl抗體，均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；其余試劑均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；酶標(biāo)檢測(cè)儀(Rayto)、冷凍離心機(jī)(heal force)、掃描儀(EPSON)、雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)、轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

50只雄性SD成年大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重(240±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成兩組：造模組40只、假手術(shù)組10只。在動(dòng)物正常休息的白天進(jìn)行造模，采用Platt法建立5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型。用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，使大鼠俯臥從距左脊骨1.5 cm處做外上方切口約1 cm，經(jīng)后腹膜暴露腎臟，分離腎周脂肪，剝離腎包膜，迅速切除上下極及左腎外側(cè)緣約2/3腎組織，用明膠海綿壓迫止血、復(fù)位、縫合，1周后切除整個(gè)右腎，兩次手術(shù)共切除5/6腎組織。假手術(shù)組只進(jìn)行剝離兩側(cè)腎包膜操作，不切除腎臟。造模后每周大鼠目?jī)?nèi)眥取血，分離血清檢測(cè)Scr、BUN含量，其均值顯著高于假手術(shù)組均值(P<0.01)認(rèn)為造模成功。(文獻(xiàn)顯示一般在造模后2周造模成功)[8]。本實(shí)驗(yàn)在造模后第二周抽檢模型組和假手術(shù)組血清Scr、BUN時(shí)，模型組均值明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，造模成功。造模過(guò)程中死亡18只，造模組剩余24只，假手術(shù)組剩余8只，將24只模型大鼠隨機(jī)抽樣分為3組(n=8)，Model組、YHT組、BH組。YHT組：將免煎顆粒加入80℃去離子水制成水溶液灌胃，(0.276 g/100 g/d，按1 ml/100 g的劑量,以中藥藥理研究方法學(xué)的大鼠與人藥物劑量折算方法折算給藥劑量)；BH組去離子水溶解貝那普利片(0.09 mg/100 g，1 ml/100 g)灌胃；Sham和Model生理鹽水灌胃(1 ml/100 g)。分組后次日即開(kāi)始灌胃治療，每天1次，連續(xù)12周為療程結(jié)束。治療結(jié)束后代謝籠留取24 h尿液，所有大鼠均麻醉(水合氯醛)腹主動(dòng)脈取血分離血清，摘取左側(cè)腎臟一部分保存于-80℃冰箱中，一部分保存于4%多聚甲醛中固定，留待檢測(cè)。

1.3 尿液中24 h尿蛋白測(cè)定

第12周治療結(jié)束時(shí)收集24 h尿液，計(jì)量尿量，通過(guò)BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)定24 h尿蛋白含量。

1.4 血清中腎功能指標(biāo)測(cè)定

第12周治療結(jié)束，麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈取血(不抗凝)，離心分離出血清，通過(guò)生化分析儀測(cè)定血清中BUN、SCr含量。

1.5 組織病理學(xué)觀察

第12周治療結(jié)束留取血清后，剖殺大鼠取出左腎并用4%多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE、Masson染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6 腎組織勻漿抗氧化酶(SOD)活性和MDA含量測(cè)定

第12周治療結(jié)束后取左腎臟組織、加入適量冷裂解液行研磨勻漿，離心(12 000 r/min 15 min)取上清液，按試劑盒說(shuō)明，通過(guò)比色法測(cè)定腎臟組織SOD活性和MDA含量。

1.7 Western blot檢測(cè)Nrf2、Keap1、Nox4、TGF-β1、Collagen1的蛋白表達(dá)

取左腎組織，按100 mg/ml加入蛋白裂解液，經(jīng)組織研磨儀破碎組織后，離心(15 min,4℃)取上清液，用BCA測(cè)定蛋白濃度。以50 μg蛋白加入2.5 μl的sample buffer,振蕩均勻,置于水浴槽，100℃水浴5 min變性，留待電泳。電泳(電泳儀設(shè)置電泳條件80 V，40 min；160 V，90 min)完成后，進(jìn)行濕轉(zhuǎn)(濕轉(zhuǎn)儀設(shè)置濕轉(zhuǎn)條件300 mA,90 min)。按Maker裁剪相應(yīng)目的蛋白的條帶，放置于孵育盒中，5%脫脂牛奶封閉蛋白條帶90 min，用TBST清洗三次，每次15 min,加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST清洗三次，每次15 min，加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)孵育90 min。TBST清洗三次，每次15 min，應(yīng)用Fusion FX5 Spectra多功能成像系統(tǒng)(法國(guó)Viber公司)發(fā)光顯色并拍照。采用Quantity One分析軟件對(duì)每個(gè)蛋白的含量進(jìn)行灰度測(cè)定分析。

1.8 熒光檢測(cè)Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)

石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精復(fù)水后，抗原修復(fù)、然后漂洗、濕盒內(nèi)封閉，一抗染色：過(guò)夜。加熒光標(biāo)記的二抗，防熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 益氣化濕通絡(luò)方對(duì)腎衰模型大鼠腎功能的影響

與Sham組相比，Model組大鼠腎功能明顯受損。與Model組相比，YHT組腎功能得到改善，能夠明顯降低大鼠的BUN、SCr、24 h尿蛋白水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。YHT組與BH組比較，BUN、SCr、24h尿蛋白未表現(xiàn)出顯著差異(表1)。

GroupScr(μmol/L)BUN(mg/dl)24hurineprotein(mg/24h)Sham38.67±5.525.98±1.150.010±0.003Model70.00±11.52##10.47±2.11##0.030±0.009##BH53.20±54.29?8.94±0.90??0.020±0.010??YHT48.00±4.85??6.66±0.96??0.020±0.012??

YHT: Yiqi huashi tongluo Formula; BH: Benazepril hydrochloride

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.2 益氣化濕通絡(luò)方對(duì)5/6腎切除慢性腎衰大鼠殘存腎臟組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)及病理無(wú)明顯異常，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球結(jié)構(gòu)正常。Model組顯示局部腎小球不同程度階段性萎縮、硬化，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生明顯，膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生明顯，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與Model相比YHT組、BH組有明顯改善，病灶區(qū)域減少，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生程度和腎小球硬化程度減輕(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

Masson染色結(jié)果顯示，Sham組沒(méi)有明顯纖維化的表現(xiàn)，膠原染色呈淡藍(lán)色。Model組大鼠腎臟膠原沉積于腎小球、腎間質(zhì)，彌漫性分布。與Model組相比，YHT組、BH組腎小球、腎間質(zhì)有絲狀膠原沉積(圖2，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

2.3 益氣化濕通絡(luò)方對(duì)腎臟組織SOD活性和MDA含量的影響

與Sham組相比，Model大鼠腎組織中SOD活性降低和MDA含量升高，與Model組相比，YHT組大鼠的腎臟組織SOD活性增加和MDA含量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。YHT組與BH組比較，未表現(xiàn)出顯著差異(表2)。

GroupSOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)Sham216.3±16.41.76±0.22Model144.3±7.0##3.80±0.44##BH180.2±6.4??2.20±0.18??YHT184.7±13.4??2.16±0.64??

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.4 益氣化濕通絡(luò)方對(duì)腎組織中Nrf2、Keap1、Nox4的蛋白表達(dá)水平的影響

與Sham組相比，Model組大鼠腎組織中，Nrf2蛋白表達(dá)水平降低，Keap1、Nox4蛋白表達(dá)水平升高；與Model組相比經(jīng)過(guò)YHT處理后能使Nrf2蛋白表達(dá)水平升高，Keap1、Nox4蛋白表達(dá)水平減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3，表3)。YHT組與BH組比較，未表現(xiàn)出顯著差異。

Fig. 3 Effects of Yiqi Huashi Tongluo Formula on the protein expression levels of Nrf2 Keap1 and Nox4 in renal tissue of rats

GroupNrf2/HistoneH3Keap1/ActinNOX4/ActinSham0.84±0.050.22±0.030.07±0.03Model0.13±0.05##0.88±0.02##0.67±0.06##BH0.56±0.03??0.53±0.06??0.36±0.02??YHT0.58±0.05??0.55±0.08??0.33±0.03??

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.5 益氣化濕通絡(luò)方對(duì)腎組織中TGF-β1、Collagen1的蛋白表達(dá)水平的影響

與Sham組相比，Model組大鼠腎組織中，TGF-β1、Collagen1蛋白表達(dá)水平升高；與Model組相比，經(jīng)過(guò)YHT處理后能使TGF-β1、Collagen1的蛋白表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4，表4)。YHT組與BH組比較，未表現(xiàn)出顯著差異。

Fig. 4 Effects of Yiqi Huashi Tongluo Formula on the protein expression levels of TGF-β1 and collagenl inrenal tissue of rats

**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vssham group

2.6 熒光檢測(cè)Nrf2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果(圖5)顯示，與Sham組相比較Model組腎組織細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)明顯減少，YHT組、BH組較Model組Nrf2的表達(dá)增多明顯(圖中放大的小圖指示為Nrf2入核的熒光表現(xiàn)，圖5見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ)。

3 討論

腎臟纖維化是ECM過(guò)度積累的結(jié)果，是CRF發(fā)展的主要病理變化之一。伴隨ECM大量沉積、腎固有細(xì)胞消失，腎小球?yàn)V過(guò)功能下降、代謝紊亂等病情出現(xiàn)并不斷加重，最終整個(gè)腎臟出現(xiàn)不可逆損傷，直至衰竭，發(fā)展成為CRF[1]。本研究建立5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型，殘腎出現(xiàn)腎小球、腎小管，間質(zhì)的增生、纖維化、萎縮、硬化等病理改變。殘腎高灌注、高濾過(guò)和高壓力,超負(fù)荷運(yùn)作,致使殘存腎單位進(jìn)行性喪失，出現(xiàn)腎臟不可逆損傷直至衰竭，與臨床患者腎衰發(fā)生發(fā)展的整個(gè)進(jìn)程相符合[8]。

益氣化濕通絡(luò)方以中醫(yī)辨證結(jié)合CRF的病理特征論治，將氧化應(yīng)激的產(chǎn)物與中醫(yī)濕濁、邪毒、瘀積相聯(lián)系。運(yùn)用泄?jié)峄局兴?藿香、佩蘭、陳皮、白豆蔻、土茯苓、積雪草)治療。CRF患者腎臟纖維化引起功能代謝下降的復(fù)雜病癥，以瀉濁化瘀通絡(luò)中藥(當(dāng)歸、川芎、紅花、地龍、水蛭)治療。CRF患者久病體虛，以益氣健脾補(bǔ)腎中藥(黃芪、仙茅、仙靈脾)治療。YHT有效地改善CRF患者因病理變化、功能代謝下降等引起的臨床癥狀。

氧化應(yīng)激是CRF病情進(jìn)展的一項(xiàng)重要誘因，貫穿疾病始終。研究證明[9]氧化應(yīng)激可直接使腎小球基底膜過(guò)氧化，通透性增加，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞外基質(zhì)累積，加快腎臟纖維化。CRF病程中存在活性氧(ROS)的損傷，ROS使脂質(zhì)分解而形成MDA，MDA隨著過(guò)氧化反應(yīng)增多而升高，引起氧自由基增多，氧自由基損傷腎臟。ROS還可影響內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞(EMT)，從而使得成纖維細(xì)胞表達(dá)增加，進(jìn)而損傷腎小球系膜細(xì)胞，加速腎臟纖維化。SOD可阻斷ROS造成的損害[10]。但CRF中SOD等抗氧化作用顯著降低。本研究檢測(cè)腎衰模型大鼠殘腎，發(fā)現(xiàn)MDA產(chǎn)生增多，SOD活性下降，提示此模型存在氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)而抗氧化反應(yīng)減弱。

抗氧化應(yīng)激是影響腎臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)反應(yīng)[11-12]。激活抗氧化應(yīng)激的重要通路，Nrf2-Keap1通路，可影響ROS的表達(dá),從而減輕腎損傷，減緩腎纖維化的進(jìn)程。Nrf2是重要的氧化還原轉(zhuǎn)錄因子。其活性主要受Keap1的調(diào)控[13]。正常條件下，Nrf2通過(guò)keap1介導(dǎo)的cullin-3(Cul3)，依賴泛素化持續(xù)降解并向蛋白酶體轉(zhuǎn)移而保持穩(wěn)定。然而，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2脫離Keap1的控制，進(jìn)入細(xì)胞核，增加抗氧化反應(yīng)元件(ARE)靶基因的表達(dá)，這些靶基因編碼調(diào)控下游抗氧化蛋白的表達(dá)[14]。Nox4[15]是下游抗氧化蛋白中的一種，當(dāng)機(jī)體遭受損傷，Nrf2上調(diào)Nox4，增加機(jī)體抗氧化損傷的能力，從而減輕損傷，減緩CRF進(jìn)程。另外，Nrf2、Nox4均可通過(guò)阻抑TGF-β1的表達(dá)而減輕纖維化[16-17]。TGF-β1被公認(rèn)是導(dǎo)致CRF、腎纖維化的一個(gè)強(qiáng)有力的中介。TGF-β1與EMT在腎小管細(xì)胞的表達(dá)及腎組織中ECM積累密切相關(guān)，TGF-β1誘導(dǎo)EMT及直接刺激ECM蛋白質(zhì)如膠原、纖粘連蛋白的表達(dá),加劇了腎臟損傷及纖維化的進(jìn)程。激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路不但減輕氧化應(yīng)激帶來(lái)的直接損傷，并使TGF-β1表達(dá)減少，達(dá)到阻抑腎臟損傷及纖維化進(jìn)程的效果。因此激活Nrf2-Keap1通路是保護(hù)腎臟的有效方法[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)YHT或BH治療后腎衰竭模型大鼠腎臟損傷、纖維化程度均明顯減輕(圖1,2)。BUN、SCr、24 h尿蛋白水平明顯降低(表1)。SOD活性增加、MDA含量降低(表2)。這些結(jié)果表明殘余腎臟腎功能得到改善，氧化應(yīng)激現(xiàn)象得到緩解。YHT治療后Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)水平升高，說(shuō)明組織抗氧化能力增強(qiáng)，Keap1、Nox4、TGF-β1、Collagen1的蛋白表達(dá)水平明顯下降(圖3，4，5)，表明YHT有效地減輕了殘腎的氧化應(yīng)激反應(yīng)及纖維化進(jìn)程，機(jī)制可能是YHT激活了抗氧化應(yīng)激通路Nrf2-Keap1及下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示YHT與BH治療效果相當(dāng)。有研究指出[19,20]，ACEI類(lèi)藥物可通過(guò)抑制腎衰模型大鼠的NAD(P)H氧化酶，繼而上調(diào)Nrf2，而改善腎臟的氧化應(yīng)激和腎功能，減緩CRF進(jìn)展。本研究從分子機(jī)制層次證實(shí)YHT有類(lèi)似于ACEI類(lèi)藥物的作用機(jī)制，可通過(guò)影響Nrf2/Keap1信號(hào)通路減輕殘腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化能力，減輕腎纖維化，為尋找YHT的臨床療效作用的分子靶點(diǎn)提供依據(jù)。

綜上所述，本研究證實(shí)5/6腎切除慢性腎衰大鼠模型存在氧化應(yīng)激及腎纖維化，腎功能障礙。YHT可能是通過(guò)影響Nrf2/Keap1信號(hào)通路,下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá),從而改善CRF大鼠因氧化應(yīng)激及腎臟纖維化引起的結(jié)構(gòu)功能損傷，改善腎功能保護(hù)腎臟，為CRF及并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治提供新的思路與試驗(yàn)依據(jù)。