軟棗獼猴桃多糖的提取及對酵母菌防紫外線的研究

李昕昕，梁佳文，聶 妍，陳曉玉，韓曉鳳，韓春然

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

0 引言

隨著科技的進(jìn)步和社會的發(fā)展，手機(jī)、電腦的普及使人們在日常生活中受到輻射的幾率大大提高，對人體有諸多不利影響，為了減少輻射對健康的影響，各種防輻射食品應(yīng)運(yùn)而生，從1997年至今，國家食品藥品監(jiān)督管理局公布的防輻射產(chǎn)品有175種，多糖為有效成分的產(chǎn)品數(shù)量最多，多糖是一類以單糖分子為基本結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，是生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和貯能物質(zhì)，能夠參與人體多種重要生命活動。研究表明，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗突變、抗衰老等多種藥理作用[1]，但這些保健品中的多糖主要來源于靈芝、當(dāng)歸等藥用植物，來源于食物的多糖很少。軟棗獼猴桃（Actinidia arguta），別名軟棗子，屬獼猴桃科、獼猴桃屬落葉藤本植物，主要分布在我國的東北、華北、華中、西北、西南，以及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)、朝鮮半島、日本等國家和地區(qū)，以我國東北地區(qū)的資源最為豐富。軟棗彌猴桃酸甜可口，富含維生素和氨基酸[2]，軟棗獼猴桃中多糖含量也較豐富[1]，以熱水浸提法提取軟棗獼猴桃中的多糖，并研究其抗紫外輻射能力，以期為軟棗獼猴桃防輻射保健食品的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃，市售；無水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供；苯酚，天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；硫酸，天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司提供；鹽酸，西隴化工股份有限公司提供；氫氧化鈉，天津市大陸化學(xué)試劑廠提供；蛋白胨，日本制造株式會社提供；酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；DGH 9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DT5-1型低速自動平衡離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；PB-10型酸度計，賽多利思科學(xué)儀器產(chǎn)品；SYQ-DSX-280A手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺型，蘇州凈化產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 軟棗獼猴桃多糖的提取

軟棗獼猴桃多糖提取工藝流程：

參考李林等人[3]的方法，略有修改。取1 g軟棗獼猴桃凍干粉、45 mL蒸餾水→混合→90℃下水浴3 h→以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min→取上清液濃縮至原體積的1/4→冷卻→加入濃縮后軟棗獼猴桃粗多糖溶液體積的4倍99.8%乙醇溶液→攪拌使其充分反應(yīng)→以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min→取離心后的沉淀→加熱揮發(fā)乙醇→加入10 mL蒸餾水充分溶解→粗多糖溶液。

1.3.2 軟棗獼猴桃粗多糖提取工藝的單因素試驗

軟棗獼猴桃多糖提取基礎(chǔ)條件為料液比1∶25，提取時間3 h，pH值7，軟棗獼猴桃粉的目數(shù)90目，分別研究提取溫度50，60，70，80，90，100℃；料液比 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；提取時間 1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h；提取 pH 值6，7，8，9，10對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響，每個水平重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.3 軟棗獼猴桃多糖提取正交試驗

（1） 正交試驗。以提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C） 和提取溶液pH值（D） 為考查因素，以粗多糖提取率為指標(biāo)，按照L9（34）進(jìn)行正交試驗，確定軟棗獼猴桃多糖最佳的提取工藝。

軟棗獼猴桃粗多糖提取正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 軟棗獼猴桃粗多糖提取正交試驗因素與水平設(shè)計

（2）驗證試驗。在獲得的最佳條件下提取軟棗獼猴桃多糖，平行3次使用最佳工藝參數(shù)的試驗，取其平均值。

1.3.4 軟棗獼猴桃多糖抗輻射能力的研究

（1）培養(yǎng)基的制作。①酵母菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制作，酵母浸出葡萄糖培養(yǎng)基（YPD） 的配制：配制500 mL培養(yǎng)溶液，稱取1%的蛋白胨5 g，0.5%的酵母膏2.5 g，充分溶解。于121℃下滅菌30 min[4]。②多糖培養(yǎng)基的制作，將獲得的軟棗獼猴桃粗多糖配成質(zhì)量濃度為0.257 g/mL的溶液，與酵母培養(yǎng)基混合，分別配置成粗多糖含量為5%，10%，15%，20%，25%的培養(yǎng)基，于121℃下滅菌30 min。冷卻后備用。

（2） 粗多糖濃度對酵母菌抗紫外照射的影響。培養(yǎng)皿中分別倒入軟棗獼猴桃多糖含量為5%，10%，15%，20%，25%的培養(yǎng)基，接入2%的酵母菌，固定紫外輻射距離75 cm，紫外輻射時間180 s，于28℃下培養(yǎng)24 h，用血球計數(shù)板計算酵母菌的數(shù)量，顯微鏡觀察酵母菌形態(tài)。每個水平重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 測定方法

（1）多糖含量的測定。①葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，精確稱取10 mg經(jīng)105℃干燥至恒質(zhì)量的分析純葡萄糖，定容到100 mL的定容瓶內(nèi)，再分別配置質(zhì)量濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[2]，分別取0.5 mL以上溶液，再分別加入5%苯酚1 mL，濃硫酸5 mL，于波長490 nm處測定不同質(zhì)量濃度溶液的吸光度A。以標(biāo)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖[5]。②軟棗獼猴桃多糖提取率的測定，準(zhǔn)確吸取5.0 mL軟棗獼猴桃粗多糖提取液，稀釋后定容于50 mL容量瓶中，充分搖勻，作為樣液。再吸取0.2 mL樣液于試管中，分別加入1.0 mL苯酚溶液、5.0 mL濃硫酸，充分搖勻放置，用1.0 mL蒸餾水作空白對照。于波長490 nm處測吸光度，平行3次。根據(jù)所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算軟棗獼猴桃粗多糖含量[5-6]。

軟棗獼猴桃粗多糖提取率計算公式：

式中：C——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的軟棗獼猴桃粗多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——定容后的總體積，mL；

n——樣液稀釋倍數(shù)；

m——軟棗獼猴桃粗多糖粉末質(zhì)量，g。

（2）酵母菌計數(shù)。采用血球計數(shù)板計算酵母菌數(shù)量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃粗多糖的提取

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，回歸方程為Y=7.94X-0.031，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.672。

2.1.2 單因素試驗

（1）提取溫度對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響。提取溫度對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)提取溫度為60～90℃時，隨著提取溫度不斷升高，軟棗獼猴桃多糖的提取率也在不斷升高；當(dāng)溫度升高至100℃時，多糖的提取率逐漸趨于平緩，甚至稍有下降。因此，當(dāng)提取溫度為90℃時較為適宜。

（2）提取時間對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響。

提取時間對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響

隨著提取時間的增加，軟棗獼猴桃多糖的提取率呈明顯的上升趨勢；當(dāng)提取時間超過3 h，多糖提取率增加幅度逐漸變小，并且呈現(xiàn)趨于平緩的趨勢。因此，提取時間在3 h較為適宜。

（3）料液比對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響。

料液比對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響

隨著提取溶液的增加，軟棗獼猴桃多糖提取率呈明顯的上升趨勢；當(dāng)料液比超過1∶25時，多糖提取率趨于平緩。因此，當(dāng)料液比為1∶25時較為適宜。

（4）提取溶液pH值對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響。

提取溶液pH值對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響見圖5。

圖5 提取溶液pH值對軟棗獼猴桃多糖提取率的影響

在提取溶液的pH值在7之前，隨著pH值的增加，軟棗獼猴桃多糖提取率不斷升高；但當(dāng)提取溶液的pH值升高至7之后，多糖提取率隨其上升而下降。因此，提取溶液pH值在7時較為適宜。

2.1.3 軟棗獼猴桃多糖提取的正交試驗

（1）正交試驗結(jié)果。

軟棗獼猴桃多糖提取的正交試驗結(jié)果與分析見表2。

由表2可知，影響軟棗獼猴桃粗多糖提取率最重要的因素為提取時間（R值為3.49），其次分別為料液比、提取溫度和提取溶液pH值。根據(jù)正交表中的極差分析，可以得到提取軟棗獼猴桃粗多糖的最優(yōu)方案為A3B2C3D1，可以從正交表中的試驗結(jié)果得出，提取溶液pH值對軟棗獼猴桃多糖提取率影響是最小的（R值為0.84），所以考慮到試驗時間、經(jīng)濟(jì)成本和環(huán)境保護(hù)，試驗將提取溶液pH值定為6.5～7.0，與實驗室用水的pH值相近。因此，可以確定使用熱水浸提法來提取軟棗獼猴桃多糖的最佳提取條件為A3B2C3D1，相對應(yīng)的數(shù)值為提取溫度90℃，提取時間3 h，料液比1∶25，提取溶液pH值為6.5～7.0。

表2 軟棗獼猴桃多糖提取的正交試驗結(jié)果與分析

（2）驗證試驗。通過以上正交表的分析，確定了使用水浸提的方法得到的提取軟棗獼猴桃多糖的最佳提取工藝參數(shù)，在此工藝參數(shù)條件下3次平行試驗，所得到3次粗多糖的提取率分別為42.74%，47.39%，44.63%，其平均值為44.92%，所得值高于正交試驗中各組合的提取率，即可確定A3B2C3D1為熱水浸提軟棗獼猴桃多糖的最佳參數(shù)工藝組合。

2.2 軟棗獼猴桃多糖對酵母菌抵抗紫外照射能力的影響

軟棗獼猴桃多糖的添加量對紫外照射后酵母菌數(shù)量的影響見圖6。

酵母菌的數(shù)量隨著粗多糖的含量上升而增加，當(dāng)多糖添加量達(dá)到20%時，與空白組酵母菌數(shù)量接近，說明此時多糖的添加量起作用?？梢?，多糖含量對酵母菌的生長有明顯影響。

3 結(jié)論

圖6 軟棗獼猴桃多糖的添加量對紫外照射后酵母菌數(shù)量的影響

采用熱水浸提法提取軟棗獼猴桃多糖，通過單因素試驗和正交試驗確定了軟棗獼猴桃提取多糖的最佳的工藝。并研究了軟棗獼猴桃多糖對酵母菌抵抗紫外線照射能力的影響。結(jié)果表明，隨著軟棗獼猴桃多糖含量的增加，經(jīng)紫外照射的酵母存活數(shù)量逐漸增加。說明軟棗獼猴桃多糖有助于酵母菌防止紫外線照射。