我國甘薯病毒病研究進(jìn)展

馬居奎，張成玲，楊冬靜，謝逸萍，孫厚俊

（江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實驗室，江蘇 徐州 221131）

甘薯（Ipomoea batatas） 是世界上重要的糧食作物以及食品加工和工業(yè)原料。我國是世界最大的甘薯生產(chǎn)國，年平均種植面積約500 萬hm2，占世界甘薯種植總面積的50%以上；年平均產(chǎn)量1 000 億kg 以上，居世界首位，在我國僅次于水稻、小麥和玉米居第4 位[1]。甘薯具有獨(dú)特的高產(chǎn)性和廣適性，曾為解決我國人民溫飽問題做出了重要貢獻(xiàn)，許多人曾有“一年甘薯半年糧”的記憶，更有“甘薯救活了一代人”的說法。在新時期，甘薯已成為我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中的優(yōu)勢作物和增加農(nóng)民收入的重要效益型經(jīng)濟(jì)作物，是改善城鄉(xiāng)居民膳食結(jié)構(gòu)的健康保健食品，“種甘薯脫貧致富，吃甘薯健康保健”已成為社會共識。

病毒病是為害甘薯生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害，可造成甘薯嚴(yán)重減產(chǎn)和品種退化。調(diào)查顯示，我國甘薯病毒病發(fā)生嚴(yán)重，一般造成產(chǎn)量損失20%～40%，嚴(yán)重時甘薯減產(chǎn)幅度可達(dá)50%以上，甚至絕收[2，3]。據(jù)報道，目前世界上侵染甘薯的病毒有9 個科38 種，我國甘薯上存在的病毒有20 種左右[4，5]。

1 甘薯病毒病種類鑒定及分布

1.1 甘薯病毒的種類

為害甘薯的病毒病主要有燕麥花葉病毒科（Bromoviridae）、布尼亞病毒科（Bunyaviridae）、花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）、長線病毒科（Closteroviridae）、豇豆鑲嵌病毒科（Conmoviridae）、彎曲病毒科（Flexividae）、雙生病毒科（Geminivirdae）、黃癥病毒科（Luteoviridae） 和馬鈴薯Y 病毒科（Potyviridae）等。主要的病毒種類有馬鈴薯Y 病毒屬的甘薯羽狀斑駁病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯潛隱病毒（sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯輕斑點(diǎn)病毒（sweet potato mild speckling virus，SPMSV）、甘薯脈花葉病毒（sweet potato vein mosaic virus，SPVMV） 和甘薯病毒G（sweet potato virus G，SPVG），以及甘薯病毒屬的甘薯輕斑駁病毒（sweet potato mild mottle virus，SPMMV） 毛形病毒屬的甘薯褪綠矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV），麝香石竹潛隱病毒屬的甘薯褪綠斑病毒（sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV） 和該屬暫定種C-6 病毒，菜豆金色黃花葉病毒屬的甘薯卷葉病毒（sweet potato leaf curl virus，SPLCV） 和黃瓜花葉病毒屬的黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV） 等[6，7]。其中馬鈴薯Y 病毒科的馬鈴薯Y 病毒屬（Potyvirus） 病毒在甘薯上最為常見。

1.2 甘薯主產(chǎn)區(qū)病毒的分布

國家甘薯改良中心（CNSIC） 和國際馬鈴薯中心（CIP） 聯(lián)合開展了中國三大薯區(qū)甘薯病毒病的發(fā)生情況調(diào)查，結(jié)果（表1） 顯示，所檢測的10 種病毒中除SPC-6 病毒外，其他9 種病毒在各大薯區(qū)均有發(fā)生，但不同省份各病毒發(fā)生的程度有所不同?？傮w而言，南方薯區(qū)的甘薯病毒病檢出率高于北方薯區(qū)和長江中下游薯區(qū)。北方薯區(qū)和長江中下游薯區(qū)SPMSV 發(fā)生最重，平均檢出率分別為55%和81%；南部薯區(qū)發(fā)生最多的病毒是SPVG，平均檢出率為46%。SPFMV 在三大薯區(qū)的發(fā)生頻率均居第2 位，北方薯區(qū)、長江中下游薯區(qū)、南方薯區(qū)的平均檢出率分別為25%、38%和36%。與1989 年調(diào)查相比，此次病毒普查中增加了4 種新病毒——SPVG、SPCSV、SPCaLV（甘薯類花椰菜花葉病毒） 和CMV。SPVG 是南方地區(qū)發(fā)生最多的病毒（檢出率46%）；在北方和長江中下游流域也較為常見，平均檢出率分別為20%和31%。SPVG在北方薯區(qū)各省的發(fā)生情況不同，其中山東省和河北省發(fā)生較重，河南省僅檢測到2 例，而在江蘇省和安徽省未檢測到。SPCSV 在北方薯區(qū)檢出率較高，特別是河北省，檢出率高達(dá)67%。SPCaLV 在長江中下游薯區(qū)和南方薯區(qū)發(fā)生較輕；在北方薯區(qū)發(fā)生較重，特別是江蘇省發(fā)病嚴(yán)重，檢出率達(dá)到41%。CMV 在三大薯區(qū)的檢出率基本一致，與Xie 等[8]的研究結(jié)果一致。

表1 我國三大薯區(qū)病毒病的檢出率[8]Table 1 Frequencies of sweet potato virus diseases in major planting regions in China

近年來，利用硝酸纖維素膜-酶聯(lián)免疫吸附測定法（NCM-ELISA）、抗原包被-酶聯(lián)免疫吸附測定法（ACP-ELISA）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）、PCR 以及核苷酸序列測定和嫁接傳染試驗等方法，對我國北方、長江中下游和南方三大薯區(qū)20多個省（市） 的甘薯病毒樣品進(jìn)行鑒定，共發(fā)現(xiàn)20 種病毒，包括9 種RNA 病毒和11 種DNA 病毒，占全球已報道甘薯病毒種類總數(shù)的66.7%。鑒定發(fā)現(xiàn)甘薯雙生病毒新種4 個（SPLCHnV，SPLCSiV-1，SPLCSiV-2，SPLCCNV-2）、新株系4 個（SPLCCV-CN，SPLCSiV-2-Js，SPLCSiV-2-Sc，SPLCV-Hn）、中國新紀(jì)錄 種7 個（SPCSV，CMV，SPBV-A，SPBV-2，SPSMV-1，SPLCGV，SPLCCV），鑒定的雙生病毒新種數(shù)占全球已報道甘薯雙生病毒種類總數(shù)的33.3%。在RNA 病毒中，SPFMV 檢出率最高，其次是SPVG。在DNA 病毒中，SPLCV 檢出率最高，為優(yōu)勢種；其次是甘薯桿狀DNA 病毒B（SPBV-B）。從地區(qū)分布上看，SPFMV 發(fā)生最為普遍，在15 個省（市） 的樣品上被檢測到；其次是SPBV-B 和SPVG，在12 個?。ㄊ校?的樣品上被檢測到[6～17]。

2012 年我國首次報道了由SPFMV 和SPCSV 協(xié)生共侵染引起的甘薯病毒?。╯weet potato virus diseases，SPVD）。研究表明，SPCSV 和SPFMV 復(fù)合侵染引起的SPVD 比單個病毒侵染時造成的為害更大，復(fù)合侵染下SPFMV 比單獨(dú)侵染時復(fù)制能力增強(qiáng)，病毒含量大幅提高[18]。感染SPVD 的甘薯主要表現(xiàn)植株矮化，葉片變窄、扭曲、褪綠、花葉和明脈等[19]。SPVD 自報道發(fā)生以來，在我國各個薯區(qū)快速蔓延，對甘薯產(chǎn)量影響極大，嚴(yán)重時可造成產(chǎn)量損失90%以上，甚至絕收，是甘薯上為害很嚴(yán)重的病毒病害之一，已成為我國甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的潛在威脅[5，8]。

2 甘薯病毒病檢測技術(shù)研究

目前甘薯病毒常用的檢測方法有癥狀學(xué)診斷法、指示劑植物檢測法、血清學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法和siRNA 深度測序技術(shù)等。其中，診斷學(xué)檢測和指示劑植物檢測常在初步鑒定中使用，血清學(xué)檢測法和PCR 檢測技術(shù)是目前較為常用的檢測方法。

2.1 癥狀學(xué)診斷法

該方法是根據(jù)甘薯葉片和薯塊上出現(xiàn)的典型癥狀來初步判斷甘薯是否感染病毒。癥狀是病毒病診斷的重要依據(jù)，但受甘薯品種、病毒種類、生育階段、環(huán)境因素的影響[19]。因此，癥狀檢測只能作為一種輔助手段，還需結(jié)合其他方法。

2.2 生物學(xué)檢測法

又稱指示植物檢測法，是將待鑒定病株葉片或其他組織的研磨汁液摩擦接種在指示植物上，或通過媒介昆蟲傳播，或采用嫁接的方法進(jìn)行接種，指示植物顯癥后觀察其癥狀表現(xiàn)，初步鑒定病毒種類[20]。檢測甘薯病毒時常用巴西牽牛作為指示植物。該方法簡便易行、成本低，可直接用于結(jié)果觀察。但部分甘薯病毒侵染巴西牽牛時表現(xiàn)出的癥狀相似，不能準(zhǔn)確地區(qū)分病毒種類。

2.3 血清學(xué)檢測法

以植物病毒中的蛋白質(zhì)或核酸為抗原，通過抗原與對應(yīng)的抗體之間能否發(fā)生特異性免疫反應(yīng)來實現(xiàn)病毒種類的快速鑒定。該方法興起于20 世紀(jì)六七十年代，目前甘薯上常用的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA） 和硝酸纖維素膜-酶聯(lián)免疫吸附法（NCM-ELISA）。

謝艷等[21]利用粉虱傳雙生病毒（WTGs） 多克隆抗體及單克隆抗體，建立了三抗體夾心ELISA（TASELISA） 檢測WTGs 的方法，并發(fā)現(xiàn)了單克隆抗體SCR18 可廣泛用于我國WTGs 的檢測。蒲志剛等[22]采用NCM-ELISA 檢測法對四川省的甘薯病毒病進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示，該地區(qū)共發(fā)生包括SPFMV、SPLV、SPVG 和SPCFV 在內(nèi)的至少4 種甘薯病毒，且不同甘薯品種和地區(qū)之間的病毒種類以及感染程度差異明顯。劉意等[23]采用NCM-ELISA 檢測法對湖北省2 個甘薯主產(chǎn)區(qū)的甘薯主栽品種進(jìn)行了病毒種類檢測，結(jié)果表明，SPFMV 發(fā)生和為害最為嚴(yán)重，其次是SPLV；2 個主產(chǎn)區(qū)的檢測樣品均未檢測到SPCSV，但這并不意味該病毒在2 個主產(chǎn)區(qū)沒有發(fā)生，應(yīng)進(jìn)一步大范圍調(diào)查驗證。

國際上已經(jīng)研制出包括SPFMV、SPCSV、SRVG、SPLV、SPCFV、SPMMV、CMV、C-6、SPCLV 和SPCaLV 等在內(nèi)的十余種甘薯病毒的抗血清。但目前用于檢測甘薯DNA 病毒的特異性抗體尚未得到廣泛應(yīng)用。喬貞貞等[24]克隆了甘薯卷葉病毒江蘇分離物SPLCV的全長基因，并對其基因結(jié)構(gòu)及分子變異情況進(jìn)行了分析，同時對外殼蛋白基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)。李學(xué)成等[25]利用PCR 結(jié)合核苷酸序列測定的方法，對SPBV-B 在我國甘薯上的發(fā)生情況進(jìn)行檢測，并在大腸桿菌中高效表達(dá)SPBV-B 外殼蛋白的部分片段，以期為該病毒的抗體制備和血清學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

2.4 PCR 檢測技術(shù)

依據(jù)甘薯病毒的基因組全長序列、衛(wèi)星分子DNA、運(yùn)動蛋白和衣殼蛋白序列設(shè)計的PCR 引物已廣泛應(yīng)用于甘薯病毒的檢測[15，26～29]。與常規(guī)PCR 檢測技術(shù)相比，多重RT-PC 技術(shù)能夠在一次反應(yīng)中同時檢測多種病毒，極大地縮短了反應(yīng)時間，提高了檢測效率。

張盼等[30]根據(jù)SPCSV 熱激蛋白基因（Hsp70） 和SPFMV 外殼蛋白基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計了4對引物，以單一RT-PCR 反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，建立了能同時檢測SPVD 兩種病原的多重RT-PCR 方法。李華偉等[31]根據(jù)Hsp70 以及SPVG 和SPFMV 的外殼蛋白基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，建立了能同時檢測SPCSV、SPVG 和SPFMV 三種病毒的多重RT-PCR 檢測方法。姜珊珊等[32]針對SPFMV、SPLV 和甘薯病毒2（SPV2） 3 種病毒的外殼蛋白基因核苷酸序列設(shè)計特異性引物，優(yōu)化擴(kuò)增條件，建立了能同時檢測這3 種病毒的多重RT-PCR 檢測體系，并高效地應(yīng)用于田間樣品檢測。蔣素華等[33]根據(jù)GenBank 中SPVG、SPLCV 和SPFMV 外殼蛋白基因序列設(shè)計特異引物，對多重RT-PCR 退火溫度、延伸溫度、模板濃度和引物濃度進(jìn)行改良優(yōu)化，建立能同時檢測3 種甘薯病毒的多重RT-PCR 方法。蔣素華等[34]為了快速進(jìn)行甘薯病毒田間檢測和脫毒苗診斷，建立了一個能夠同時檢測SPCSV、SPLV 和SPFMV 這3 種病毒的多重RT-PCR 檢測方法。應(yīng)用多重RT-PCR 檢測方法可穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏地同時檢測單一或復(fù)合侵染的多種甘薯病毒，為甘薯脫毒和病毒病診斷奠定了基礎(chǔ)。

實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR） 技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新型的核酸定性、定量技術(shù)，既有普通PCR 靈敏、快速的特點(diǎn)，還可實時監(jiān)測，已應(yīng)用于多種植物病毒的檢測。王麗等[35，36]分別依據(jù)GenBank 中登錄的SPCSV 西非株系（WA） 的核苷酸序列和SPFMVQ 外殼蛋白基因的保守區(qū)設(shè)計引物和TaqMan 探針，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了SPCSV-WA 和SPFMV 的實時熒光定量PCR 檢測方法。盧會翔等[37]以甘薯泛素編碼基因（ubiquitin，UBI） 和組蛋白編碼基因（histone，H2B） 為雙內(nèi)參，篩選出可利用SPFMV 外殼蛋白基因與SPCSV HSP70 轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測的最佳熒光定量RT-PCR 檢測引物，采用甘薯染病葉片總RNA 進(jìn)行熒光定量RT-PCR 檢測，并通過與NCM-ELISA 檢測結(jié)果進(jìn)行比較、驗證，建立了可直接對供試材料中2 種病毒存在狀況進(jìn)行快速檢測的方法。田雨婷等[38]根據(jù)我國已檢測到8 種甘薯雙生病毒（sweepoviruses） 的全長基因組序列，設(shè)計一對通用引物和一條TanMan探針，通過對反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，建立了sweepoviruses 的實時熒光定量PCR 檢測方法。熒光定量RTPCR 檢測方法解決了ELISA 技術(shù)靈敏度低、特異性差以及普通PCR 方法不能對病毒進(jìn)行定量分析等問題。

喬奇等[39]以SPCSV 西非株系（SPCSV-WA） 的外殼蛋白基因核苷酸序列基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP） 建立了SPCSV-WA 的RT-LAMP 快速檢驗技術(shù)；姜姍姍等[40]以SPFMV 的外殼蛋白基因核苷酸序列建立了SPFMV 的RT-LAMP 快速檢驗技術(shù)。RT-LAMP 快速檢驗技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單，適用于甘薯病毒的田間快速檢測。

3 甘薯病毒病防控措施

3.1 控制傳染源

甘薯屬于無性繁殖植物，病毒侵染后會在其體內(nèi)逐漸積累，隨著繁殖代數(shù)的增加，甘薯卷葉、褪綠、矮化和皺縮等癥狀會加劇，因此嚴(yán)格控制并切斷病毒的傳染源是預(yù)防甘薯病毒病的重要措施[41]。首先，做好包括大田周圍寄生植物及其病株殘體在內(nèi)的田園清理工作，防止外來可侵染甘薯病毒對甘薯產(chǎn)生為害。其次，加強(qiáng)苗期管理，拔除病毒疑似病株。此外，還要做好病毒的排查和檢疫工作，在甘薯種質(zhì)材料引種、交換過程中盡量使用脫毒種薯、種苗，無脫毒苗時要對引進(jìn)材料進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，以防病毒進(jìn)一步擴(kuò)散和跨區(qū)域傳播。

3.2 切斷傳播途徑

以粉虱、蚜蟲為代表的傳毒昆蟲在病毒傳播中起主要作用，因此在生產(chǎn)中，要特別注意粉虱和蚜蟲等傳播介質(zhì)的防控。常用的防治方法主要有物理防治、化學(xué)殺蟲劑防治和生物防控等。常見的物理防治手段有色板誘殺、植物誘控等技術(shù)，實行間作或者輪作，打破傳毒昆蟲在寄主植物上的生活規(guī)律等。應(yīng)用化學(xué)殺蟲劑仍是現(xiàn)階段滅殺傳毒昆蟲的主要手段，大田生產(chǎn)中常用的化學(xué)殺蟲劑有抗蚜威、噻蟲嗪、吡蟲啉等。應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥殺蟲雖然效果好，但存在農(nóng)藥殘留，使害蟲產(chǎn)生抗藥性，對農(nóng)作物產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響，對人類健康造成威脅等問題。生物防控可以有效緩解病蟲害的抗藥性以及農(nóng)藥殘留等問題。目前發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)煙粉虱寄生性天敵有4 個科56 個種，捕食性天敵有31 個科114 個種。王聯(lián)德等[42，43]研究表明，釋放粉虱天敵麗蚜小峰、小黑瓢蟲等，培養(yǎng)粉虱蟲生真菌與化學(xué)防治相結(jié)合的方式可有效控制煙粉虱的為害。

3.3 施用抗病毒農(nóng)藥

抗病毒農(nóng)藥的主要作用是抑制病毒對植物的侵染、復(fù)制、繁殖以及病毒癥狀的表達(dá)，或誘導(dǎo)植物的生化機(jī)理產(chǎn)生變化，誘導(dǎo)植物對病毒產(chǎn)生抗性等。張成玲等[44]研究了6 種藥劑對SPVD 薯苗生物學(xué)特性及品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，病毒苗藥劑處理后薯塊粗淀粉含量和粗蛋白含量均較對照顯著提高。

3.4 選育抗病品種

甘薯常規(guī)育種一般采用集團(tuán)雜交的方法篩選具有天然抗病性的優(yōu)良育種材料，再經(jīng)過深入研究來驗證其具有抗病毒特性。采用常規(guī)方法育種需要收集具有較豐富抗病性的育種材料，但目前可以應(yīng)用到甘薯抗病毒育種方面的材料較少，因此，深入挖掘、搜集和鑒定甘薯野生抗病性近緣種，豐富甘薯育種材料尤為重要。

4 展望

我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，甘薯病毒病是嚴(yán)重制約我國甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大病害。近年來甘薯病毒病在我國各個薯區(qū)快速蔓延，對甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)造成了極大損失。目前，對于甘薯病毒病的研究主要集中在病毒檢測和致病機(jī)制機(jī)理研究方面，尚未探明甘薯病毒病的分布和流行規(guī)律，對其綜合防控能力較弱。天然抗病毒品種資源不足，病毒進(jìn)化又會進(jìn)一步干擾抗病品種的選育；轉(zhuǎn)基因抗病毒甘薯周期長、抗性不穩(wěn)定等制約因素使得甘薯病毒病為害嚴(yán)重。因此，為促進(jìn)我國甘薯產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，需要進(jìn)一步探明我國甘薯病毒病的發(fā)生情況，明確甘薯病毒病的種類和分布范圍；探究多種病毒的侵染機(jī)制，建立和健全無病健康種苗繁殖技術(shù)與檢測技術(shù)；因地制宜，制定適宜的病毒防治措施；建立成熟、規(guī)范化的甘薯脫毒苗繁育體系，降低脫毒甘薯的生產(chǎn)成本，使其更加快速地應(yīng)用于實際生產(chǎn)。