一株荒漠產(chǎn)油微藻的篩選及其生長和產(chǎn)油的pH響應

戴文娜，童 旭，張 琴，蔣 卉，李艷賓

(1.安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000； 2.塔里木大學 生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

微藻具有光合作用效率高、生長周期短、不占用耕地、可利用廢水生長、油脂含量高等優(yōu)點，近年來微藻生物柴油作為第三代生物質能源備受國內外廣泛關注[1-2]。據(jù)估計，自然界有5萬多種微藻，但只有百余種得到較好的開發(fā)利用[3]，從自然界篩選高產(chǎn)油藻株仍是微藻生物柴油研究開發(fā)的重點和基礎[4]。特殊環(huán)境往往蘊藏著特殊的生物資源，近年來從荒漠等極端環(huán)境中篩選抗逆藻株逐漸受到研究者的重視?；哪異毫拥纳姝h(huán)境使得該地區(qū)微藻通常具有抗輻射、抗鹽堿、耐受溫度變化等高抗逆性和較好地適應環(huán)境變化的特點[5-6]，與其他微藻相比，更適合于大規(guī)模室外培養(yǎng)，特別是在利用不能耕種的荒漠和鹽堿灘涂地作為培養(yǎng)基地方面有重要的應用潛力[5-7]。

微藻生長與油脂積累受光照、溫度、營養(yǎng)、pH等諸多環(huán)境因素的影響[8-9]，其中pH是微藻培養(yǎng)中最關鍵的環(huán)境條件之一，其決定了CO2和營養(yǎng)物質的溶解度和可利用性，對微藻生長和胞內產(chǎn)物的形成有重要影響[10-11]。有研究指出，一些小球藻、柵藻等在高pH下培養(yǎng)，胞內油脂積累得更快[12-13]，在此環(huán)境中微生物的多樣性也相對較低，因此有利于對耐高pH產(chǎn)油微藻進行室外開放培養(yǎng)[14]。但另一方面，高pH也將一定程度限制CO2的可利用性，從而抑制細胞生長[10]。每種微藻都有一個最佳的pH范圍適于細胞生長和油脂積累，且該pH范圍較窄，并具有菌株特異性，難以得出最優(yōu)pH的一般規(guī)律[10]。因此，對于特定的微藻，探明pH對其生長和油脂積累的影響，并合理控制藻液pH，是促進微藻快速生長并大量積累油脂的重要保證。

新疆是典型的大陸性干旱氣候區(qū)，吳蕾等[15]曾對該地區(qū)的微藻進行了廣泛調查，共鑒定出陸生藻77種、水生藻272種，表明該地區(qū)有豐富的藻類資源。目前為止，針對我國荒漠地區(qū)微藻的研究，大多仍集中在微藻資源的收集[16]、鑒定[17]、群落分析[15,18]等階段，也有少數(shù)以荒漠化治理為目的開展了相關研究[19-20]，但將荒漠微藻用于開發(fā)生物能源相關的系統(tǒng)研究仍鮮有報道。積極開展荒漠產(chǎn)油微藻資源的收集與篩選，對微藻生物柴油的開發(fā)應用將起到重要的推動作用。本研究從新疆塔里木盆地荒漠鹽堿水灘中分離得到一株產(chǎn)油微藻，在分析其生長與產(chǎn)油特性的基礎上，進一步對該藻株進行了鑒定，并探討了pH對微藻生長和油脂積累特性的影響，以期為荒漠產(chǎn)油微藻資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 水樣

本實驗分離微藻所用水樣采自新疆塔里木盆地荒漠鹽堿水灘(N40°38.198′，E81°53.145′)，該水灘為地下滲水，地表無注入水源，水面有少許油膜，水灘周圍有少量蘆葦，測得該水pH為7.8。用25號浮游生物網(wǎng)將表層水進行濃縮，置于30 mL水樣瓶保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

藻種分離及培養(yǎng)所用培養(yǎng)基以BG11培養(yǎng)基為基礎加以改良：葡萄糖10 g、KNO31.25 g、KH2PO41.25 g、MgSO4·7H2O 1 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CaCl2·2H2O 0.111 g、EDTA 0.5 g、H3BO30.114 2 g、MnCl2·4H2O 0.014 2 g、Na2MoO40.007 1 g、CuSO4·7H2O 0.015 7 g、CoSO40.001 g、水1 000 mL，pH 7.0，115℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉18 g/L，藻種分離培養(yǎng)基加30 μg/mL硫酸鏈霉素。

微藻基本培養(yǎng)條件：溫度28℃，光照強度5 000 lx，光照周期12 h/12 h。

1.1.3 試劑與儀器

葡萄糖、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、EDTA、H3BO3、MnCl2·4H2O、Na2MoO4、CuSO4·7H2O、CoSO4、NaOH、HCl、DMSO、甲醇、氯仿，均為分析純；尼羅紅(≥98%)，Sigma公司。

AR1140電子天平，奧克斯國際貿易(上海)有限公司；PHS-3C精密pH計，上海虹益儀器儀表有限公司；SW-CT-CF超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TD6M低速離心機，湖南凱達儀器科學儀器公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；DM1000 雙目正置生物顯微鏡，徠卡；BX53熒光數(shù)碼顯微鏡，奧林巴斯；GZX-80B光照培養(yǎng)箱，上海力辰邦西儀器科技有限公司；DHG-9053A鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微藻分離與產(chǎn)油微藻篩選

采集的水樣經(jīng)6 000 r/min離心10 min，棄上清液，于液體分離培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)3～5 d，每天定期搖晃1次。而后在固體培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，并挑取單藻落反復劃線純化，在光學顯微鏡下檢測微藻形態(tài)，同時采用尼羅紅染色法[21]對微藻細胞油脂含量進行定性檢測，選擇生長良好、產(chǎn)油量高的純藻株，接種至斜面，4℃下保藏。

1.2.2 產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)

將配制好的培養(yǎng)基分裝至150 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶裝30 mL，滅菌后進行微藻活化與培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取4～5環(huán)藻細胞至培養(yǎng)基中進行微藻活化，培養(yǎng) 7 d 后按10%(體積比)接種量接種至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2 d取樣用血球計數(shù)板計藻細胞數(shù)，并測定微藻細胞油脂含量。

1.2.3 尼羅紅染色法定性檢測微藻細胞油脂含量[21]

挑取適量微藻細胞懸于200 μL無菌生理鹽水中，依次加入尼羅紅染液3 μL、二甲基亞砜(DMSO)75 μL，振蕩混勻，40℃下恒溫保持10 min，然后6 000 r/min離心10 min，去掉上清液，以無菌生理鹽水混勻后離心，反復洗滌4次，最后加入200 μL生理鹽水，混勻后制片，在熒光顯微鏡下觀察。熒光強弱可反映微藻細胞內油脂含量的高低。

1.2.4 微藻細胞油脂含量定量測定及油脂產(chǎn)量、油脂產(chǎn)率計算

取兩瓶培養(yǎng)至一定時間的培養(yǎng)液，均以6 000 r/min離心10 min，沉淀用蒸餾水反復洗滌3次，得到濕藻體，其中一瓶的濕藻體烘干至恒重，另一瓶的濕藻體用于油脂含量的測定。采用氯仿-甲醇法測定油脂含量：向濕藻體中添加鹽酸(按每克濕藻體加10 mL 4 mol/L的鹽酸)，振蕩混勻，室溫下處理一定時間后，沸水浴3～5 min，立即置于-20℃速冷，冷卻后，加入與鹽酸等體積的甲醇，振蕩2 min混勻，再加等體積氯仿，振蕩2 min，6 000 r/min離心10 min，收集下層氯仿層，再加入等體積的 0.15%氯化鈉溶液，混勻后6 000 r/min離心10 min，收集下層氯仿層，在旋轉蒸發(fā)儀上蒸除氯仿，于80℃烘至恒重，記錄質量。按下式計算油脂含量、油脂產(chǎn)量和油脂產(chǎn)率。

油脂含量=油脂質量/藻體干重×100%

油脂產(chǎn)量=油脂質量/藻液體積

油脂產(chǎn)率=油脂質量/(藻液體積×培養(yǎng)時間)

1.2.5 產(chǎn)油微藻分子生物學鑒定

微藻培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，6 000 r/min離心10 min，收集藻細胞。取100 mg藻細胞，在無菌研缽中用液氮研磨，用DNA 提取試劑盒(EasyPureTM Plant Genomic DNA Kit)提取微藻總DNA，用ITS1/ITS4通用引物(ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR擴增其ITS序列，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果在GenBank上進行BLAST同源序列搜索，挑選相關近源藻序列，用ClustalW軟件進行多序列對齊，并用MEGA 6.05軟件以相鄰法構建其系統(tǒng)發(fā)育樹，重復1 000次計算bootstrap值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均平行測定3次，采用SPSS 18.0和Origin 8.5軟件進行統(tǒng)計分析、作圖。

2 結果與分析

2.1 荒漠產(chǎn)油微藻的分離篩選

從采集的水樣中共分離到10余株純藻株，根據(jù)鏡檢及其生長特征，初步鑒定均為綠藻，其中大部分為小球藻，有4株疑為實球藻、空球藻和柵藻。從尼羅紅染色結果觀察來看，所有微藻均能檢測到不同強度的紅色熒光，其中一株編號為DT025的小球藻熒光發(fā)射強度最高(見圖1)，故選擇該藻株進行后續(xù)實驗。該藻以單細胞狀態(tài)存在，藻落呈綠色奶油狀、扁平形，初步判斷為小球藻。

圖1 荒漠產(chǎn)油微藻DT025普通光及尼羅紅染色熒光激發(fā)照片

2.2 微藻DT025的生長及油脂積累特性

荒漠產(chǎn)油微藻DT025按1.2.2方法活化、培養(yǎng)，其生長曲線及油脂積累特性見圖2。

圖2 荒漠產(chǎn)油微藻DT025的生長曲線與油脂積累特性

從圖2可以看出：培養(yǎng)前2 d，微藻DT025的生長趨勢相對較緩，可視此階段為延緩期，但從細胞數(shù)量上來說，培養(yǎng)2 d時微藻細胞增長了幾乎1倍，說明微藻DT025能較好地適應培養(yǎng)環(huán)境，在本實驗培養(yǎng)條件下延緩期不明顯；培養(yǎng)2～8 d，微藻細胞近指數(shù)增長，此階段為對數(shù)生長期；培養(yǎng)8～10 d，微藻細胞增長變緩，此階段為平穩(wěn)期，此后微藻細胞數(shù)量變化不大，增長緩慢。

從圖2還可以看出：在培養(yǎng)前8 d，微藻細胞油脂含量逐漸升高，特別是從培養(yǎng)4 d起，油脂含量增加迅速，此時對應微藻對數(shù)生長期，表明在此培養(yǎng)條件下，微藻油脂積累在時間上與微藻細胞生長同步，這與其他報道[11,22]的結果類似，可能是在培養(yǎng)過程中，除了細胞增殖，微藻還利用培養(yǎng)基中的碳源進行油脂的合成[11]；培養(yǎng)8 d時微藻細胞油脂含量達到峰值(37.13%)，此后油脂含量呈現(xiàn)小幅波動下降，但整體上維持在30%左右，直到培養(yǎng)18 d時油脂含量又有一定幅度上升。從生長及油脂積累特性來看，微藻DT025生長迅速，含油量較高，具有較好的開發(fā)利用價值。

2.3 微藻DT025的分子生物學鑒定

將按1.2.2方法培養(yǎng)7 d的微藻DT025，按1.2.5方法用通用引物對其ITS序列進行PCR擴增并測序，獲得擴增序列長度為787 bp，該序列已提交GenBank，登錄號為MN 328729。挑選部分相似序列與該藻系列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)，結果發(fā)現(xiàn)，微藻DT025與小球藻Chlorellasp. SLA-04、Chlorellasp. Rys、ChlorellasorokinianaUTEX246聚為一類，同源性均在99%以上，其中與Chlorellasp. SLA-04同源性達99.59%。綜上，將微藻DT025鑒定為小球藻，命名為Chlorellasp. DT025。

圖3 基于ITS序列的荒漠產(chǎn)油微藻DT025系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 pH對Chlorella sp. DT025生長及油脂積累的影響

采用磷酸鹽緩沖液和硼砂緩沖液將培養(yǎng)基pH分別調節(jié)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，然后按1.2.2方法對Chlorellasp. DT025進行活化、培養(yǎng)，考察Chlorellasp. DT025在不同pH下的生長及油脂積累情況，結果如圖4所示。

圖4 pH對Chlorella sp. DT025生長及油脂積累的影響

從圖4可以看出，在pH 6.0～9.0范圍內，微藻DT025均能較好地生長，說明其具有較寬的pH耐受范圍。另外，在pH 6.0～9.0范圍內，微藻DT025的生長表現(xiàn)出相似的趨勢，總體在培養(yǎng)2 d起，細胞數(shù)量快速增長，進入對數(shù)生長期， pH 7.5和pH 8.0在培養(yǎng)6 d時進入穩(wěn)定期， pH 6.5、7.0、8.5在培養(yǎng)8 d時進入穩(wěn)定期，而pH 6.0、9.0則生長相對較緩，分別在培養(yǎng)12、14 d時達到峰值進入穩(wěn)定期，說明pH過高或者過低，均會對微藻的生長造成較大影響。此外，pH 9.5時微藻的生長幾乎處于停滯狀態(tài)，細胞數(shù)相比接種時無明顯變化，能觀察到微藻有明顯的絮凝沉降，表明該微藻不適合在pH大于9.5的環(huán)境中生長。

從圖4還可以看出：在培養(yǎng)前4 d，各pH下微藻細胞的油脂含量普遍較低，之后隨培養(yǎng)時間的延長，除了pH 6.0，其余pH的微藻細胞油脂含量均迅速增加，達到峰值后逐漸呈現(xiàn)降低趨勢，這與前述微藻油脂積累特性分析結果一致。在培養(yǎng)周期內，pH 6.0時微藻細胞油脂含量較低，增加緩慢，說明低pH不利于油脂積累。高pH時微藻細胞油脂含量普遍要高于低pH時的，在pH 9.5時微藻細胞油脂含量最高，培養(yǎng)10 d可達到46.93%，說明高pH脅迫有利于油脂積累，這與已有研究報道[12-13]結論一致。

脅迫環(huán)境下如何平衡微藻產(chǎn)油量和生長量之間的關系是微藻油脂開發(fā)的重要問題[23]。雖然在pH 9.5時微藻細胞油脂含量高，但此時微藻細胞數(shù)量很少，這將影響最終的油脂產(chǎn)量。為比較微藻在不同pH時的產(chǎn)油能力，計算了不同pH時微藻在穩(wěn)定期的油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率，結果見表1。

表1 不同pH時Chlorella sp. DT025的油脂產(chǎn)量與產(chǎn)率

由表1可知，在pH 7.0～8.0時，微藻的油脂產(chǎn)量及產(chǎn)率均比較高，說明該藻適宜培養(yǎng)產(chǎn)油的pH在7.0～8.0之間，其中pH 7.5條件下，微藻的油脂產(chǎn)量與產(chǎn)率均為最高，分別為1.580 g/L、0.198 g/(L·d)。此外，在pH 8.0、8.5時，微藻的油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率也分別達到了1.460 g/L、0.183 g/(L·d)和0.859 g/L、0.107 g/(L·d)，體現(xiàn)出該藻良好的堿耐受能力。

3 結 論

從新疆荒漠鹽堿水灘中分離得到一株產(chǎn)油微藻DT025，該藻能較好地適應培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)2 d起快速生長，4 d起開始大量積累油脂，具備較好的開發(fā)利用價值，經(jīng)分子生物學鑒定為小球藻Chlorellasp.。該藻pH耐受范圍較寬，適于培養(yǎng)產(chǎn)油的pH范圍為7.0～8.0，其中pH 7.5時產(chǎn)油能力達到最高。