北桑寄生內(nèi)生真菌的分離及其次級代謝產(chǎn)物分析

盧丹丹，鄭鼎玉，陳 婕，楊官娥

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指其生活周期某一階段寄生在植物組織中，但是對植物不會造成明顯病害癥狀的一類真菌[1]。內(nèi)生真菌與宿主植物互利共生，共同進(jìn)化，其次級代謝產(chǎn)物可能會與宿主植物具有相似或者相同的生物活性，且不同宿主植物中分離出的內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物會存在多樣性[2]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物在抗腫瘤、抗病原微生物、抗氧化等方面具有很好的活性，并且可從中尋找到具有新穎結(jié)構(gòu)或者新的生物活性的化合物[3,4]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物中含有生物堿、多肽、甾體、萜類等抗菌物質(zhì)，以及黃酮類、酚酸類、香豆素類等抗氧化物質(zhì)[5,6]。由此可見，植物內(nèi)生真菌是潛力巨大的微生物新資源。

北桑寄生(LoranthustanakaeFranch.et Sav.)為桑寄生科桑寄生屬藥用植物，主要寄生于櫟屬、榆屬、李屬、樺屬等植物上[7]。具有強(qiáng)健筋骨、祛風(fēng)除濕、降血壓等功效，其提取物具有抗腫瘤、抑菌、抗平滑肌細(xì)胞增殖等活性[8,9]。北桑寄生資源匱乏，對生境要求較高，是具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值和空氣污染指示的藥用植物[10]。目前沒有關(guān)于北桑寄生內(nèi)生真菌的相 關(guān)報(bào)道。本文首次對北桑寄生葉片中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，篩選抗氧化和抑菌活性較強(qiáng)的菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對活性菌株進(jìn)行鑒定，并對活性菌株的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)鑒定。為開發(fā)和利用北桑寄生內(nèi)生真菌資源提供了參考依據(jù)。

1 材料

1.1 北桑寄生

北桑寄生植株于2018年9月采自陜西省鳳縣，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院白云娥副教授鑒定為北桑寄生LoranthustanakaeFranch.et Sav，標(biāo)本編號BS201809。

1.2 供試菌株

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC33694、變形桿菌(Proteusspecies)ATCC13315、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC23857由山西醫(yī)科大學(xué)微生物教研室贈送。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯200 g煮沸過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水至1 000 mL，pH自然。PDB培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯200 g煮沸過濾，葡萄糖20 g，蒸餾水至1 000 mL，pH自然。NA培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.6。NB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.2～7.6。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離純化

將采集的新鮮北桑寄生葉片自來水沖洗干凈。在無菌操作條件下，用75%的乙醇漂洗1 min，無菌水漂洗3次，再用5%的次氯酸鈉溶液漂洗5 min，無菌水漂洗3次，最后用75%乙醇漂洗30 s，無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸去表面水分。將葉片切割成1 cm×1 cm左右的小塊，平貼在PDA培養(yǎng)基上。置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～7天，待組織邊緣長出菌絲，采用菌絲尖端挑取法將菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基中，分離純化直到得到單一菌落為止，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

北桑寄生內(nèi)生真菌分離過程中設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)表面消毒是否徹底，確保分離得到的是內(nèi)生真菌。一是漂洗液檢測：取最后一次漂洗后的無菌水0.2 mL涂布在PDA培養(yǎng)基上，觀察培養(yǎng)結(jié)果。二是組織印跡法：消毒后的葉片用無菌濾紙吸干表面水分，不經(jīng)過切割直接放于培養(yǎng)基表面，使之與培養(yǎng)基表面接觸3～5 min，然后取出。觀察培養(yǎng)結(jié)果。

2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物的制備

北桑寄生內(nèi)生真菌活化培養(yǎng)后，接種至PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)7天。將發(fā)酵液減壓濃縮，用兩倍體積的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，減壓濃縮后得浸膏。

2.3 北桑寄生內(nèi)生真菌抗氧化活性菌株的篩選

將內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物用無水乙醇溶解，配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液?？箟难嶙鳛殛栃詫φ?，用無水乙醇配制成和樣品濃度相同的溶液。

2.3.1 DPPH自由基清除測定

取不同濃度樣品溶液各2 mL，加入0.025 mg/mL DPPH乙醇溶液2 mL，混勻，避光靜置30 min，取0.2 mL于96孔板中，在517 nm處測得吸光度，記為A1，樣品2 mL + 無水乙醇2 mL吸光度為空白，記為A2，以無水乙醇2 mL + DPPH 2 mL吸光度為對照，記為A0。重復(fù)三次。

清除率=[1-(A1-A2)/A0] × 100%

2.3.2 ABTS+自由基清除測定

將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，避光室溫反應(yīng)12～14小時(shí)，形成ABTS+母液。將ABTS+母液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處測得吸光度值為0.70 ± 0.002。取不同濃度的樣品溶液0.2 mL，分別加入稀釋后的ABTS+液體0.8 mL，混勻，避光反應(yīng)10 min，取0.2 mL于96孔板中，在734 nm處測得吸光度，記為A1，以無水乙醇0.2 mL + ABTS+液體0.8 mL吸光度為對照，記為A0。重復(fù)三次。

清除率=(A0-A1)/A0× 100%

2.4 北桑寄生內(nèi)生真菌抑菌活性菌株的篩選

采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法對活性菌株進(jìn)一步篩選。將內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物用適量的DMSO配制成濃度為50 mg/mL的溶液。培養(yǎng)皿中加入200 μL供試細(xì)菌菌液(106～108CFU/mL)和滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，制成含菌平板。取20 μL的樣品溶液滴于無菌濾紙片上(直徑6 mm)，平貼在含菌平板上，37 ℃培養(yǎng)24小時(shí)測量抑菌圈大小，重復(fù)三次。DMSO溶液為陰性對照，青霉素鉀(500 μg/mL)和硫酸鏈霉素(500 μg/mL)分別作為革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的陽性對照。

采用96孔板法進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)的測定。取無菌96孔板，1～7孔中分別加入100 μL的NB培養(yǎng)基，取樣品溶液(50 mg/mL)100 μL加到1號孔中，混勻(濃度為25 mg/mL)，從中取出100 μL加到2號孔中，混勻，依次稀釋到7號孔，7號孔中取出100 μL棄去。1～7號孔中樣品濃度依次為25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781 5、0.390 75 mg/mL，于37 ℃培養(yǎng)24小時(shí)。同一塊96孔板上不加樣品只加菌液的小孔作為陽性對照，以不加菌液只加培養(yǎng)基的小孔作為陰性對照。觀察孔中培養(yǎng)液澄清的最低濃度為MIC，取觀察后澄清的孔液50 μL液體涂布到NA培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)24小時(shí)，重復(fù)三次，NA培養(yǎng)基上完全沒有細(xì)菌生長的最低濃度為MBC。

2.5 內(nèi)生真菌BS27的鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將具有較高生物活性的菌株BS27接種在新鮮的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)7天，觀察菌落的生長速度、菌落顏色、質(zhì)地等變化。挑取菌絲，用乳酸棉蘭染色液染色，在顯微鏡下觀察記錄。

2.5.2 分子生物學(xué)鑒定

采用真菌柱式DNA提取試劑盒提取真菌DNA，真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1.5 min，34個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI的Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析。利用MEGA 5.0軟件和鄰接法(neighbor-joining methods)進(jìn)行聚類分析鑒定種屬。

2.6 內(nèi)生真菌BS27的次級代謝產(chǎn)物研究

內(nèi)生真菌BS27發(fā)酵培養(yǎng)后，菌絲于40 ℃烘箱干燥，以75%乙醇(W/V：1∶20)超聲萃取兩次，萃取液經(jīng)50 ℃減壓濃縮后，得菌絲體浸膏(8.5 g)。發(fā)酵液經(jīng)40 ℃減壓濃縮至原體積的1/10，以兩倍體積的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液減壓濃縮，得發(fā)酵液浸膏(3.2 g)。

菌絲體浸膏經(jīng)硅膠柱以石油醚-乙酸乙酯(15∶1→1∶1)梯度洗脫得到5個組分(A～E)，組分D經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1(4.3 mg)，組分E經(jīng)硅膠柱以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脫得到化合物2(25.6 mg)。發(fā)酵液浸膏經(jīng)硅膠柱以石油醚-乙酸乙酯(7∶1→1∶1)梯度洗脫得到4個組分(F～I(xiàn))，其中組分G為化合物3(47 mg)。

對單體化合物進(jìn)行抗氧化活性和抑菌活性分析，抗氧化實(shí)驗(yàn)具體操作同本文2.3部分。抑菌實(shí)驗(yàn)其中1號孔樣品終濃度為0.1 mg/mL，其余具體操作同本文“2.4”部分的96孔板法。

3 結(jié)果與分析

3.1 北桑寄生內(nèi)生真菌分離

經(jīng)過組織塊法和菌絲尖端挑取法分離得到北桑寄生內(nèi)生真菌共計(jì)29株，依次編號為BS01～BS29，表明北桑寄生中存在豐富的內(nèi)生真菌資源。在對照實(shí)驗(yàn)中，漂洗液檢測法和組織印記法的培養(yǎng)平板上均未出現(xiàn)菌落生長現(xiàn)象，表明實(shí)驗(yàn)過程中表面消毒徹底，分離得到的是北桑寄生的內(nèi)生真菌。

3.2 北桑寄生內(nèi)生真菌抗氧化活性菌株的篩選

通過DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)測定了29株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力，研究結(jié)果表明，有3株內(nèi)生真菌BS06、BS07和BS27對DPPH自由基有較好的清除能力(圖1)，對ABTS自由基清除能力較弱(圖2)，且隨著發(fā)酵產(chǎn)物濃度的增加清除能力也增強(qiáng)。其中內(nèi)生真菌BS27的發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力較好，濃度為0.2 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到95.17%，接近于同等濃度下Vc對DPPH自由基的清除能力。

圖1 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基的清除活性Fig.1 DPPH radical scavenging efficiency of fermentation products of endophydic fungi

圖2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對ABTS自由基的清除活性Fig.2 ABTS radical scavenging efficiency of fermentation products of endophydic fungi

3.3 北桑寄生內(nèi)生真菌抑菌活性菌株的篩選

對具有較好抗氧化活性的3株內(nèi)生真菌測定其抑菌能力，結(jié)果表明3株內(nèi)生真菌BS06、BS07和BS27對4種供試細(xì)菌中的革蘭陽性細(xì)菌均有一定的抑菌能力，對革蘭陰性細(xì)菌無明顯的抑菌能力。其中內(nèi)生真菌BS27的抑菌能力最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈達(dá)到15.60 mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈達(dá)到14.35 mm。金黃色葡萄球菌陽性對照的抑菌圈為20.10 mm，枯草芽孢桿菌的陽性對照抑菌圈為18.40 mm。采用96孔板法進(jìn)一步對內(nèi)生真菌BS27進(jìn)行MIC和MBC的測定，其對金黃色葡萄球菌的MIC值為12.5 mg/mL，MBC值為25 mg/mL；對枯草芽孢桿菌的MIC值為6.25 mg/mL，MBC值為12.5 mg/mL。

3.4 內(nèi)生真菌BS27的鑒定

內(nèi)生真菌BS27接種在PDA培養(yǎng)基上，生長速度快，無可溶性色素產(chǎn)生。3天后菌落直徑可達(dá)2.5 cm，表面呈白色絲狀絨毛，較蓬松；5天后菌落鋪滿整個平板，表面中間呈現(xiàn)為灰黑色，外周呈現(xiàn)為白色，背面中間黑褐色，外周白色，菌落呈明顯同心圓形。(圖3A和B)。乳酸棉蘭染色液對其菌絲染色后觀察，菌絲呈管狀，有分枝，有橫隔膜，部分菌絲膨大，在菌絲的側(cè)邊有囊狀突起，無孢子產(chǎn)生。(圖3C)初步確定為鏈格孢屬內(nèi)生真菌。

圖3 內(nèi)生真菌BS27的形態(tài)特征及顯微形態(tài)圖Fig.3 Morphological characteristics and micromorphology of strain BS27注：A：BS27菌株正面特征；B：BS27菌株反面特征；C：BS27菌株顯微形態(tài)圖。Notes:A:Positive characteristics of strain BS27;B:Reverse characteristics of strain BS27;C:Micromorphology of BS27 strain.

以引物ITS1和ITS4對內(nèi)生真菌BS27的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，BS27的ITS序列的長度為544 bp，序列如下：

TGGGCATCATATGAGGCGGGCTGGACCTCTCG

GGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTT

TTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCAC

CACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAAT

CAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCA

ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAA

CGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAG

AATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT

GCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCG

AGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTG

GGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTT

AAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGC

GCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCT

AGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTC

GGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCAT

ATCAATAAACGGAGGAAAA

將此序列與NCBI的Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對，選取相似度較高的序列，利用MEGA 5.0軟件和鄰接法(neighbor-joining methods)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)合BS27的形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定BS27為Alternariaalternate內(nèi)生真菌。

3.5 單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過硅膠柱色譜、重結(jié)晶等方法從北桑寄生內(nèi)生真菌BS27的發(fā)酵產(chǎn)物中得到3個化合物。經(jīng)過1H NMR和13C NMR波譜技術(shù)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，其結(jié)構(gòu)如圖5所示。

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z271.2 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，pyridine-d5)δ：12.54(1H，s，3-OH)，7.31(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，7.02(2H，q，J=2.5 Hz，H-10，H-12)，6.79(1H，d，J=2.2 Hz，H-4)，3.82(3H，s，H-15)，2.71(3H，s，H-14)；13C NMR(101 MHz，pyridine-d5)δ：166.6(C-5)，165.7(C-7)，165.3(C-3)，160.0(C-11)，153.6(C-9)，138.7(C-13)，138.6(C-1)，118.4(C-12)，109.6(C-8)，103.9(C-6)，102.4(C-10)，99.5(C-2)，99.2(C-4)，55.5(C-15)，25.2(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故確定化合物1為alternariol-5-O-methyl ether。

圖4 內(nèi)生真菌BS27的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the ITS sequences of endophytic fungus strain BS27

圖5 化合物1～3的結(jié)構(gòu)式Fig.5 Structures of compounds 1-3

化合物2淡黃色粉末；ESI-MS：m/z257.2 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，pyridine-d5)δ：12.57(1H，s，3-OH)，7.45(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，7.00(1H，d，J=2.6 Hz，H-12)，6.96(1H，d，J=2.4 Hz，H-10)，6.90(1H，d，J=2.0 Hz，H-4)，2.55(3H，s，H-14)；13C NMR(101 MHz，pyridine-d5)δ：167.6(C-7)，166.6(C-5)，166.3(C-3)，160.6(C-11)，154.5(C-9)，139.9(C-13)，139.4(C-1)，126.3(C-8)，119.1(C-12)，110.7(C-6)，105.9(C-10)，103.2(C-2)，102.6(C-4)，26.0(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故確定化合物2為alternariol。

化合物3淡黃色油狀；ESI-MS：m/z279.1 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3，)δ：5.34(4H，m，H-9，H-10，H-12，H-13)，2.77(2H，t，J=6.4 Hz，H-11)，2.34(1H，t，J=7.5 Hz，H-2)，2.03(4H，m，J=6.7 Hz，H-8，H-14)；13C NMR(101 MHz，CDCl3)δ：180.3(C-1)，130.2(C-12)，130.0(C-10)，128.1(C-13)，127.9(C-9)，34.1(C-2)，31.9(C-16)，29.7(C-7)，29.4(C-15，C-6)，29.2(C-4)，29.1(C-5)，27.2(C-8，C-14)，25.7(C-11)，24.7(C-3)，22.7(C-17)，14.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故確定化合物3為cis,cis-9,12-octadecadienoic acid。

3.6 單體化合物活性檢測

對單體化合物進(jìn)行抗氧化活性和抑菌活性檢測。3個單體化合物的抗氧化活性較弱，其中化合物1和2對ABTS自由基有較弱的清除能力，在0.2 mg/mL的濃度下，化合物1對ABTS自由基清除率為16.15%，化合物2對ABTS自由基清除率為21.49%。抑菌活性檢測結(jié)果表明化合物1和3具有一定抑菌活性，陽性對照組細(xì)菌正常生長，陰性對照組無細(xì)菌生長，結(jié)果見表1。

4 結(jié)論

利用組織塊法從藥用植物北桑寄生的葉片中首次分離純化得到29株內(nèi)生真菌，表明北桑寄生中內(nèi)生真菌資源豐富，從中篩選得到一株具有較好抗氧化活性和抑菌活性的內(nèi)生真菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為Alternariaalternate，對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，分離得到3個單體化合物。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物3有較好的清除DPPH自由基和ABTA+自由基的能力[14]，化合物1和3對大腸埃希菌等多種耐藥菌具有抑菌活性[15]，化合物1和2有一定的細(xì)胞毒性，對敏感細(xì)胞有致畸、致癌、致突變作用[16]。目前鏈格孢屬內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為藥物或其先導(dǎo)化合物的重要資源[17]。本研究并未分離得到與北桑寄生化學(xué)成分結(jié)構(gòu)相似或結(jié)構(gòu)新穎的化合物，可能是由于培養(yǎng)基成分單一，導(dǎo)致菌株的沉默基因未被激活，后期將考慮在內(nèi)生真菌培養(yǎng)過程加入小分子物質(zhì)激活沉默基因簇，對代謝產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行分離純化和單體化合物活性篩選，從而得到結(jié)構(gòu)新穎、復(fù)雜的活性化合物。

表1 化合物1～3抑菌活性結(jié)果(n=3,μg/mL)

注：“-”表示化合物無抑菌活性

Note：“-” indicated that the compound has no bacteriostatic action