精制竹醋與中藥提取物的抑菌增效作用分析

谷 瑤，李桂珍，溫如斯，楊 漓

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002）

竹醋液是竹材熱解得到的液體產(chǎn)物，是一種組成成分相當(dāng)復(fù)雜的深紅褐色液體混合物，其主要成分是水、有機(jī)酸、酚類、酮類、醇類等物質(zhì)，pH值2.20～3.01，相對(duì)密度1.02左右，其成分隨著竹種、生產(chǎn)條件、收集方法、加工處理工藝、包裝、貯存運(yùn)輸條件等的不同而不斷變化[1-3]。竹醋液在食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用[4-6]。在食品加工方面，竹醋液主要用于熏制火腿和香腸，也可用作熏煙味的食品添加劑。竹醋液具有較強(qiáng)的熏香感和醋酸味，具有魚(yú)肉、保鮮、防止油脂、維A被氧化，防腐、殺菌的作用。但是，竹醋液含有大量的酚類物質(zhì)，特有的竹焦油和醋酸影響了食品的風(fēng)味，對(duì)食品安全也帶來(lái)一定影響。試驗(yàn)旨在為竹醋液更好地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域、減少化學(xué)殺菌劑的使用量，以及為研制低毒殺菌制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

竹醋液原液、精制竹醋，桂林綠竹有限公司提供；厚樸、黃連、苦參、蛇床子、菖蒲及獨(dú)活，南寧萬(wàn)藥堂藥業(yè)有限公司提供；中和劑選擇為含0.5%卵磷脂+0.5%組氨酸+1.0%吐溫-80的PBS溶液，上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、白色念珠菌（C.albicans）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa） 第7～9代，中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏中心提供；小白鼠、白色家兔，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；白色豚鼠，昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；其他材料及試劑，南寧市藍(lán)天試驗(yàn)器材有限公司提供。

1.2 儀器和設(shè)備

HH·B11·600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；JY10001型電子天平，上海雙旭電子有限公司產(chǎn)品；HNW-S-6型電熱恒溫水浴箱，上海汗諾儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 中藥的提取

厚樸、黃連、苦參、蛇床子、菖蒲及獨(dú)活經(jīng)烘干（60℃，8 h）粉碎后，分別稱取50 g溶于200 mL純化水中，微沸浸提1 h后，過(guò)濾收集濾液，抽真空狀態(tài)下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并濃縮到50 g。

1.3.2 菌懸液的制備

細(xì)菌在細(xì)菌培養(yǎng)基斜面上于37℃下活化24 h，白色念珠菌在沙氏培養(yǎng)基斜面上于30℃下活化48 h，備用。將活化后的菌種用生理鹽水配置成105～110個(gè)/mL（血球計(jì)數(shù)法）的菌懸液，備用。

1.3.3 抑菌作用的測(cè)定

取樣品于超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌水配成體積分?jǐn)?shù)不同的稀釋液。取50 μL菌懸液（細(xì)菌為1×106個(gè)/mL，真菌為1×105個(gè)/mL） 鋪板，將濾紙片放至平板中央，加30 μL樣品，以水作為對(duì)照組。適溫培養(yǎng)（細(xì)菌于37℃下培養(yǎng)，白色念珠菌于28℃下培養(yǎng)），待對(duì)照長(zhǎng)滿后，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.4 殺菌作用的測(cè)定

每支試管加入2.5 mL配置好的樣品（培養(yǎng)基混合物），然后再加入0.5 mL菌懸液（細(xì)菌1×107個(gè)/mL、白色念珠菌1×107個(gè)/mL），充分振蕩后，搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為細(xì)菌溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min；白色念珠菌溫度28℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)24 h；取50 μL菌液涂板，待對(duì)照組長(zhǎng)滿板后，觀察結(jié)果。

1.3.5 生物形容性的測(cè)定

根據(jù)GB 15979—2002《消毒技術(shù)規(guī)范》Technical standard for disinfection（2002年版） 進(jìn)行急性經(jīng)口毒性、皮膚刺激、陰道黏膜刺激、皮膚變態(tài)反應(yīng)等試驗(yàn)。

1.3.6 精制竹醋與中藥提取物復(fù)配作用評(píng)價(jià)

將厚樸、黃連提取物與精制竹醋按照2∶1，1.5∶1，1∶1，1∶1.5，1∶2進(jìn)行配比，制備精制竹醋與中藥提取物不同配比的復(fù)配制劑，根據(jù)1.3.4進(jìn)行殺菌作用測(cè)定。

（1）增效作用計(jì)算方法。①以所混化學(xué)藥劑為標(biāo)準(zhǔn)藥劑，則：

A的相對(duì)毒力指數(shù)：

所用標(biāo)準(zhǔn)藥劑的相對(duì)毒力指數(shù)：

TlI=100.

組合物M的理論毒力指數(shù)：

組合物M的實(shí)際毒力指數(shù)：

②增效作用的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。一般認(rèn)為共毒系數(shù)CTC＞120具增效作用，CTC=80～120為相加作用，CTC＜80為拮抗作用。共毒系數(shù)采用孫云沛方法計(jì)算，CTC=(ATI/TTI)×100。CTC＞120為增效作用，CTC=80～120為相加作用，CTC＜80為拮抗作用[7-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種竹醋液的理化性質(zhì)

2種竹醋液理化性質(zhì)對(duì)照見(jiàn)表1。

表1 2種竹醋液理化性質(zhì)對(duì)照

竹醋液原液精制后能夠去除大部分竹焦油，精制后竹醋的折光率降低了5.9%，說(shuō)明精制后去除了大量的大分子物質(zhì)及雜質(zhì)，可以更好地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。

2.2 2種竹醋液的抑菌及殺菌作用

2種竹醋液的抑菌效果比較見(jiàn)表2。

表2 2種竹醋液的抑菌效果比較

由表2可知，竹醋液原液對(duì)4種菌的抑制效果皆優(yōu)于精制竹醋，并且2種竹醋液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較為接近，這與常雅寧等人[10]通過(guò)竹醋液對(duì)食品污染菌的抗菌作用的研究結(jié)果相吻合。

2種竹醋液對(duì)供試菌的致死濃度見(jiàn)表3。

表2比較了竹醋液原液和精制竹醋對(duì)4種指示菌的致死濃度。由表3可知，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 25%及以上的竹醋液原液和精制竹醋可完全抑制4種受試菌的生長(zhǎng)。此外，2種竹醋液對(duì)E.coli及S.aureus的最低殺菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為5%，殺菌效果較為接近。而精制竹醋對(duì)P.aeruginosa的殺菌效果優(yōu)于C.albicans，但對(duì)二者的最低殺菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于竹醋液原液。

表3 2種竹醋液對(duì)供試菌的致死濃度

2.3 中藥提取物的抑菌作用

中藥提取物的抑菌作用見(jiàn)表4。

表4 中藥提取物的抑菌作用

由表4可知，參照北京藥品檢驗(yàn)所提供的常規(guī)抗生素藥敏抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)，抑菌圈在21 mm以上，為抑菌能力強(qiáng)，以“+++”表示；在16～21 mm為抑菌能力較強(qiáng)，以“++”表示；15 mm以下為抑菌能力弱，以“+”表示；無(wú)抑菌圈出現(xiàn)為無(wú)抑菌作用，用“-”表示。中藥藥液的平均藥物質(zhì)量濃度為7.5 mg/mL。由表3可知，厚樸及黃連對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均優(yōu)于其他中藥，同時(shí)，黃連對(duì)于白色念珠菌的抑制效果最佳。

2.4 混合劑的抑菌及增效作用

選擇厚樸和黃連、苦參、蛇床子、菖蒲、獨(dú)活浸提物與精制竹醋按照1∶1質(zhì)量比輔配，厚樸和黃連、苦參、蛇床子與精制竹醋具有增效作用，其中厚樸和黃連與精制竹醋具有明顯增效作用，菖蒲、獨(dú)活與精制竹醋沒(méi)有增效作用。

不同混合制劑對(duì)4種菌的抑制作用見(jiàn)表5。

由表5可知，同一配比，黃連與精制竹醋混劑的增效作用均高于厚樸與精制竹醋混劑，并且C∶A=1.5～2∶1時(shí)效果最佳。

表5 不同混合制劑對(duì)4種菌的抑制作用

表6 受試物對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 混合劑的生物相容性

2.5.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

受試物對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

混合制劑對(duì)小鼠的急性經(jīng)口LD50大于5 000 mg/kg BW，根據(jù)消毒劑的急性評(píng)價(jià)規(guī)定，混合劑的急性經(jīng)口毒性屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。

2.5.2 皮膚刺激試驗(yàn)

受試物對(duì)家兔多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

混合制劑對(duì)家兔多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果為無(wú)刺激性。

2.5.3 陰道黏膜刺激試驗(yàn)

肉眼觀察染毒組和對(duì)照組各有2只家兔陰道黏膜可見(jiàn)輕微充血，染毒組有2只家兔陰道黏膜分別可見(jiàn)輕度和明顯的水腫，對(duì)照組未見(jiàn)水腫。病理檢查結(jié)果感染組的病例評(píng)分均值為7.33，對(duì)照組的評(píng)分均值為5.33，陰道黏膜刺激指數(shù)為0.33。

表7 受試物對(duì)家兔多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

試驗(yàn)組豚鼠在激發(fā)接觸混合劑后24，48 h均未見(jiàn)受試皮膚出現(xiàn)紅斑及水腫等刺激反應(yīng)，皮膚致敏率為0；陽(yáng)性對(duì)照組使用的陽(yáng)性物為2.4-二硝基氯苯（致敏和激發(fā)質(zhì)量濃度分別為10，8 mg/mL），致敏率為70%；陰性對(duì)照組豚鼠受試皮膚未見(jiàn)異常。結(jié)果表明，混合劑對(duì)豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果為未見(jiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)。

3 結(jié)論

竹醋液原液精制后抑菌及殺菌效果皆減弱，厚樸、黃連提取物對(duì)大腸桿菌及白色念球珠菌的抑菌效果優(yōu)于連翹、牡丹皮、菖蒲及獨(dú)活提取物；厚樸和黃連、苦參、蛇床子與精制竹醋具有增效作用，菖蒲、獨(dú)活與精制竹醋沒(méi)有增效作用；黃連與精制竹醋混合制劑對(duì)4種菌的抑制效果最佳，并且此混合制劑屬于實(shí)際無(wú)毒級(jí)，對(duì)家兔皮膚進(jìn)行多次刺激都表現(xiàn)為無(wú)刺激性，對(duì)豚鼠皮膚無(wú)致變態(tài)反應(yīng)作用，但對(duì)家兔陰道黏膜有極輕刺激性，體現(xiàn)良好的生物相容性。