基于響應(yīng)面法的華金6號(hào)金銀花葉總黃酮有效部位的制備及其體外抗氧化活性研究

姜 珊，張康華，孫 平，代 龍，張 芳，高 鵬

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250300）

金銀花為忍冬 （Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，主要含有木犀草苷等黃酮類成分、綠原酸等酚酸類成分和以馬錢苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類成分（劉嬋娟等，2010）。研究表明金銀花具有抗病原微生物、抗氧化、抗病毒等藥理作用（劉敬盛，2016；潘秋文，2004），尤其是在抑菌、抗氧化領(lǐng)域，其活性甚至比花高（楊海霞等，2013）。因此，金銀花葉可應(yīng)用于飼料抑菌添加劑和食品抗氧化劑等方面。華金6號(hào)金銀花是山東中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)過10余年培育出的金銀花新品種（王玲娜等，2017、2016）。該品種金銀花葉資源豐富，成本較低，可作為飼料添加劑，具有很高的開發(fā)價(jià)值。

近年來，從天然植物中尋找自由基消除劑是現(xiàn)代食品和藥品行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。通過化學(xué)方法合成的抗氧化劑毒性較大，風(fēng)險(xiǎn)較高，常會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。以中草藥及其有效成分進(jìn)行抗氧化研究，已成為近年研究的熱點(diǎn)，其中黃酮類成分被認(rèn)為抗氧化效果較理想。研究表明，金銀花葉總黃酮粗提物具有良好的抗氧化活性 （鄭必勝等，2013；武雪芬等，1999），但是對(duì)于金銀花葉總黃酮純化物的抗氧化活性研究較少。為了得到純度較高的金銀花葉總黃酮有效部位，本試驗(yàn)采用D101型大孔吸附樹脂對(duì)金銀花葉總黃酮進(jìn)行純化工藝優(yōu)選，為今后金銀花葉總黃酮類成分抗氧化活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 金銀花葉 金銀花葉（2018年6月采集于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，樣品經(jīng)鑒定為華金六號(hào)金銀花）置于室內(nèi)通風(fēng)干燥處，自然陰干后粉碎，備用。

1.2 藥品與試劑 D101、HPD-100、S-8、NKA-9型大孔吸附樹脂 （滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；蘆丁對(duì)照品（純度≥98%，上海源葉生物）；DPPH、ABTS（上海麥克林公司）；乙醇（天津市四通化工廠）；維生素 C（Vc）（購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 高速粉碎機(jī) （上海兆申科技有限公司，XS-02）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL-204）；移液槍（Dragon-Lab）；紫外-可見光光度儀（上海儀電分析儀器廠，L3S）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；恒溫振蕩儀（金壇市宏華儀器廠，SHA-CA型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（林茂科技，101型）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 金銀花葉總黃酮的提取及含量測(cè)定

2.1.1 金銀花葉總黃酮的含量測(cè)定 根據(jù)崔鵬等（2018）方法，采用紫外分光光度法，繪制蘆丁對(duì)照品（0.1995 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)得回歸方程A=11.95C+0.0059，r=0.9994，線性范圍 0~0.2 mg/mL。

供試品含量測(cè)定：取供試品溶液1 mL于25 mL容量瓶中加 5%的 NaNO2溶液 1 mL，10%的 Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置5 min后加4%的NaOH溶液10 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測(cè)吸光度，從回歸方程中計(jì)算總黃酮的濃度。

2.1.2 金銀花葉總黃酮的提取 根據(jù)李志明（2006）方法，設(shè)計(jì) L9（34)正交試驗(yàn)，料液比 1：25、超聲時(shí)間50 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲溫度30℃時(shí)黃酮提取率最高。即金銀花葉經(jīng)干燥粉碎后，精密稱取約1 g粉末（過三號(hào)篩），于索氏提取器中回流至石油醚無色，將處理后的金銀花粉末置于具塞錐形瓶中精密加入25倍量60%乙醇，超聲處理 （功率500 W，頻率40 kHz)50 min，用60%的乙醇補(bǔ)足減失的重量，放冷至室溫，抽濾，抽濾液減壓濃縮回收乙醇，濃縮液置100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，測(cè)定含量。

2.2 金銀花葉總黃酮的分離純化

2.2.1 大孔樹脂預(yù)處理 將 D101、HPD-100、HPD-300、NKA-9型大孔吸附樹脂95%醇洗、3%酸洗、3%堿洗后用去離子水洗至中性后，70℃烘干備用。

2.2.2 樹脂篩選 根據(jù)姚佳等（2018）的方法，分別稱取上述預(yù)處理好的四種大孔吸附樹脂各1 g于100 mL錐形瓶中，分別加入金銀花葉總黃酮提取液25 mL（1.53 mg/mL），置于振蕩儀中吸附12 h后測(cè)定上層液中總黃酮濃度。將上述吸附飽和的樹脂加入25 mL 60%乙醇振蕩解吸12 h，過濾并檢測(cè)濾液中黃酮濃度。相關(guān)參數(shù)計(jì)算公式如下：

靜態(tài)吸附量/（mg/g）＝V藥液×（C0－C1）/m；

靜態(tài)解吸量/（mg/g）＝V洗脫液×C2/m；

靜態(tài)解吸率/%＝靜態(tài)解析量/靜態(tài)吸附量×100；

式中：C0為黃酮初始濃度，mg/mL；C1為黃酮剩余濃度，mg/mL；C2為洗脫液中黃酮濃度，mg/mL；m 為樹脂質(zhì)量，g。

2.2.3 樹脂純化工藝 D101型大孔吸附樹脂純化工藝的優(yōu)選參考馬翠霞等（2018）方法。

2.2.3.1 泄露曲線測(cè)定 取30 mL D101型大孔吸附樹脂，裝柱，取“2.1.2”提取液 （1.53 mg/mL)15 mL上樣，上樣流速為1 mL/min，收集流出液，每15 mL收集1份，共上樣90 mL。按“2.1.1”方法測(cè)定總黃酮含量，并以上樣液體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線。

2.2.3.2 上樣流速的選擇 稱取4份預(yù)處理好的等體積D101大孔吸附樹脂，濕法裝柱，去離子水平衡后加入“2.1.2”粗提液（1.53 mg/mL)，上樣液流量分別為 1、2、3、4 mL/min 進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集并測(cè)定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

2.2.3.3 洗脫溶劑體積的選擇 按照 “2.2.3.2”方法裝柱5個(gè)，上樣流速選擇最佳值，吸附平衡后，洗脫溶劑流量 2 mL/min，分別以 2、3 、4、 5、 6 BV 60%的乙醇水溶液洗脫，測(cè)定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

2.2.3.4 洗脫溶劑濃度的選擇 操作同上，分別以體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、50%、60%、80%的乙醇水溶液，以流量2 mL/min進(jìn)行洗脫，測(cè)定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

2.2.3.5 洗脫流速的選擇 操作同上，加入等體積60%的乙醇水溶液洗脫，流量為1、2、3、4 mL/min，測(cè)定流出液中金銀花葉總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

2.2.3.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選金銀花葉總黃酮純化工藝 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)中心組合（Box-Benhnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以上樣流速（A）、洗脫溶劑體積（B）、洗脫溶劑濃度（C）、洗脫溶劑流速（D）為自變量，總黃酮解吸率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1）。在優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表

2.2.3.7 純度測(cè)定 根據(jù)張星等（2018）的方法，按最優(yōu)工藝純化分離后得到的金銀花葉總黃酮進(jìn)行純度測(cè)定：

純度=Cd×Vd×100%/m；

式中：Cd為解吸溶液中金銀花葉總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；Vd為解吸溶液體積，mL；m 為干膏質(zhì)量。

2.3 金銀花葉總黃酮的體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.3.1 DPPH自由基清除能力 參照姚新鼎等（2019）和夏娜等（2014）的測(cè)定方法并稍加修改。配制 DPPH乙醇溶液 （52.8μg/mL），取 1 mL DPPH乙醇溶液與1 mL不同濃度的樣品溶液或Vc溶液充分混勻，室溫下暗處放置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。計(jì)算公式如下：

DPPH 自由基清除率=1-（A1-A2）/A0；

式中：A1為樣品組吸光度，A2為樣品本底吸光度（以等體積無水乙醇代替DPPH溶液），A0為空白對(duì)照組吸光度 （以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

2.3.2 ABTS+自由基的清除能力 參照黃琴等（2014）和范艷麗等（2017）的測(cè)定方法并稍加修改。配制7 mmol/mL的ABTS+溶液，室溫下與等體積的4.9 mmol/mL過硫酸鉀溶液混合后暗處放置12 h，制成ABTS+儲(chǔ)備液，用pH 7.4的磷酸緩沖液稀釋儲(chǔ)備液20倍制成ABTS+工作液。取不同濃度的樣品溶液和Vc溶液 1 mL，加入 2.0 mL的ABTS+工作液，震搖均勻后常溫暗處放置10 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。計(jì)算公式如下：

ABTS+自由基清除率=1-（A1-A2）/A0；

式中：A1為樣品組吸光度，A2為樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替ABTS+溶液），A0為空白對(duì)照組吸光度（以等體積蒸餾水代替樣品溶液）。

3 結(jié)果與分析

3.1 大孔樹脂的篩選 由表2可以看出，非極性大孔吸附樹脂D101、HPD-100的吸附性能均高于中級(jí)性和極性大孔吸附樹脂S-8和NKA-9，可達(dá)到65%以上。同時(shí)，大孔樹脂比表面積越大越有利于吸附 （王慧芳等，2018），D101型大孔吸附樹脂的比表面積稍大于HPD-100型大孔樹脂，兼顧吸附解吸性能，選擇D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行金銀花葉總黃酮的分離純化，并對(duì)其進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。

表2 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及解吸分析

3.2 D101型大孔吸附樹脂分離純化工藝優(yōu)選

3.2.1 泄露曲線測(cè)定 由圖1可以看出，上樣液體積為60~75 mL時(shí)吸光度增加0.01，大于75 mL時(shí)，金銀花葉總黃酮開始大量泄漏，因此最終確定漏點(diǎn)為60 mL，即為2倍柱體積。因此1 mL大孔吸附樹脂最大上樣量須小于2 mL。

3.2.2 上樣流速的選擇 由圖2可以看出，流速為2~3 mL/min時(shí)，黃酮類物質(zhì)吸附率緩慢上升。流速大于3 mL/min時(shí)，黃酮類物質(zhì)吸附率迅速下降。當(dāng)上樣流速為1 mL/min時(shí)，黃酮吸附率為 85%，當(dāng)上樣液流速為2 mL/min時(shí)，黃酮吸附率為84%。但是，當(dāng)流速為1 mL/min時(shí)上樣較慢，上樣時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)造成金銀花葉總黃酮的死吸附，使解吸率下降。當(dāng)流速為3 mL/min時(shí)，上樣較快，容易導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)吸附不完全，造成損失。因此，選擇上樣流速為2 mL/min。

3.2.3 洗脫溶劑體積的選擇 由圖 3可以看出，當(dāng)洗脫劑體積大于4 BV時(shí)，解吸率緩慢變化，即4 BV洗脫劑已經(jīng)足以將金銀花葉總黃酮洗脫。洗脫劑用量過大時(shí)，造成浪費(fèi)不經(jīng)濟(jì)，并且減壓濃縮回收乙醇比較耗時(shí)，因此，洗脫溶劑體積選擇4 BV。

3.2.4 洗脫溶劑濃度的選擇 由圖4可以看出，當(dāng)洗脫溶劑濃度為20%~60%時(shí)，解吸率隨乙醇濃度的增加而升高，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)上升時(shí)，解吸率下降。其原因是黃酮類化合物與大孔吸附樹脂之間存在范德華力，當(dāng)兩者極性接近時(shí)解吸率達(dá)到最大（王慧芳等，2018）。D101型大孔吸附樹脂為弱極性樹脂，金銀花葉總黃酮為弱極性分子，因此洗脫乙醇濃度越大，極性越小，越有利于金銀花葉總黃酮的洗脫，但是當(dāng)乙醇的濃度繼續(xù)增加到80%時(shí)，金銀花葉總黃酮的解吸率反而降低，這主要是因?yàn)?，醇溶性雜質(zhì)隨之增多，導(dǎo)致總黃酮的解吸率下降，綜上，選擇60%的乙醇作為洗脫溶劑。

3.2.5 洗脫流速的選擇 由圖5可知，當(dāng)洗脫劑流速為2 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最大，當(dāng)洗脫劑流速繼續(xù)增大反而使解吸率下降，主要原因是乙醇體積流量流速過大，洗脫液還未來得及洗脫樹脂上吸附的黃酮分子就已流了出去，因此選擇的洗脫流速為2 mL/min。

3.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化D101型大孔吸附樹脂分離純化工藝

3.2.6.1 Box-Behnken響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

3.2.6.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 采用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)表3中總黃酮解吸率進(jìn)行多元回歸擬合，得金銀花葉總黃酮解吸率與A、B、C、D四因素變量的二次多元回歸模型為：

Y=85.40+1.65A+0.95B+1.37C+0.36D+0.26AB-0.97AC-0.67AD+0.17BC-0.20BD+0.26CD-0.76A2-2.87B2-2.77C2-2.65D2，對(duì)所得數(shù)據(jù)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知，模型P＜0.01，是極顯著的，說明方程有意義，而失擬項(xiàng)P=0.0684，大于0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即模型與試驗(yàn)的差異較小，說明其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，殘差由隨機(jī)誤差引起，能充分反映各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系（姚新鼎等，2019）。另外，總黃酮得率回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2a為0.9853，校正系數(shù) R2adj=0.9706，均＞0.9，說明此模型能說明試驗(yàn)中97.06%的響應(yīng)值變化，因此可以用此回歸方程對(duì)D101型大孔吸附樹脂優(yōu)化金銀花葉純化工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從單因素水平來看，各因素對(duì)D101型大孔吸附樹脂純化金銀花葉總黃酮解吸率影響的主次順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，即上樣流速＞洗脫溶劑濃度＞洗脫溶劑體積＞洗脫溶劑流速。響應(yīng)面對(duì)于單因素A、B、C、D值構(gòu)成的三維空間及其在二維平面上的等高線圖，可以直觀地反映各因素之間的相互作用，通過軟件處理得到的響應(yīng)面見圖 6。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面方差分析結(jié)果

3.2.6.3 D101型大孔吸附樹脂最優(yōu)純化工藝和驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到最優(yōu)純化工藝：乙醇濃度為60.19%，乙醇體積為4.09倍柱體積，上樣流速為2.56 mL/min，洗脫流速為2.16 mL/min，在該條件下金銀花葉總黃酮的解吸率為86.1109%。為了實(shí)際操作可行性，最終將純化工藝條件修改為乙醇濃度為60%，乙醇體積為4倍柱體積，上樣流速為2.5 mL/min，洗脫流速為2 mL/min。對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化的分離純化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，制備3批樣品，金銀花葉總黃酮的解吸率分別為86.52%、87.09%和85.77%。選用優(yōu)化后的樹脂純化工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)的3批樣品，金銀花葉總黃酮的解吸率基本穩(wěn)定，可用于金銀花葉總黃酮的大規(guī)模分離純化。

3.2.6.4 純度測(cè)定 根據(jù)純化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，制備3批樣品的金銀花葉總黃酮的純度見表5。

表5 三批金銀花葉總黃酮純度

3.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 DPPH自由基清除能力試驗(yàn)結(jié)果 由圖7可知，總黃酮質(zhì)量濃度為0~28.6μg/mL時(shí)，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率隨之增加。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為22.88μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到82.40%，陽(yáng)性對(duì)照Vc為77.02%。以上結(jié)果表明金銀花葉總黃酮對(duì)DPPH自由基有良好的清除的能力。金銀花葉總黃酮清除DPPH自由基的機(jī)理可能是因?yàn)辄S酮樣品中具有供氫體，可以提供質(zhì)子還原具有氧化性的自由基，終止自由基的連鎖反應(yīng)，起到抑制或清除自由基的作用（羅磊等，2018）。

3.3.2 ABTS+自由基的清除能力試驗(yàn)結(jié)果 由圖8可知，總黃酮質(zhì)量濃度為0~35.75μg/mL時(shí)，隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增加，ABTS+自由基清除率隨之增加。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為21.45μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基清除率達(dá)到92.01%，之后在總黃酮質(zhì)量濃度為28.60~35.75μg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除率保持相對(duì)穩(wěn)定?？傸S酮質(zhì)量濃度為35.75μg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+自由基清除率達(dá)到91.32%，高于同濃度陽(yáng)性對(duì)照Vc對(duì)ABTS+自由基清除率85.97%。以上結(jié)果說金銀花葉總黃酮具有很高的清除ABTS+自由基的能力。

4 討論

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法優(yōu)化了D101大孔吸附樹脂制備華金6號(hào)金銀花葉總黃酮有效部位的工藝，得到最佳制備方案：粗提液上樣流速為2.5 mL/min，洗脫溶劑為60%乙醇，洗脫溶劑體積為4倍柱體積，洗脫流速為2 mL/min；此方法總黃酮提取率與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值非常接近，純度可達(dá)60%以上，工藝穩(wěn)定可行，可為華金6號(hào)新品種金銀花葉總黃酮類成分的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

黃酮類化合物分離純化的方法有很多種，氧化鋁層析法、聚酰胺吸附樹脂吸附法、大孔樹脂吸附法等，與其他方法相比，大孔吸附樹脂具有成本低、分離效率高、操作簡(jiǎn)單、無毒性、可工業(yè)化大批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于黃酮類成分的純化 （向海燕等，2017；張華潭，2015）。因此，本試驗(yàn)采用D101型大孔吸附樹脂對(duì)金銀花葉進(jìn)行分離純化，為金銀花葉總黃酮類成分的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可有效地減少試驗(yàn)次數(shù)，縮短試驗(yàn)周期，分析結(jié)果直觀清晰，且可考察各因素之間的交互作用。本試驗(yàn)通過Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)金銀花葉總黃酮純化工藝進(jìn)行優(yōu)選，準(zhǔn)確地得到最佳純化方案，此純化方案為以后的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

體外抗氧化活性試驗(yàn)表明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)華金6號(hào)金銀花葉總黃酮有效部位的體外抗氧化能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，并呈劑量依賴性，與羅磊（2018）的研究結(jié)果一致。純化后的金銀花葉總黃酮的ABTS+自由基清除能力高于同濃度的Vc清除能力，DPPH自由基的清除能力接近同濃度的Vc清除能力，金銀花葉黃酮具有良好的體外抗氧化性。