牦牛卵丘細(xì)胞體外培養(yǎng)方法優(yōu)化

李晶晶潘陽(yáng)陽(yáng)馬睿韓小紅張翠蘭余四九*

（1，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心 730070；2，甘肅省永登縣疫病預(yù)防控制中心 730300）

家畜的繁殖性狀是其重要的經(jīng)濟(jì)性狀，卵巢是雌性動(dòng)物生殖的基礎(chǔ)，卵泡是卵巢的基本功能單位，是卵子發(fā)生的微環(huán)境，當(dāng)卵泡發(fā)育至有腔卵泡期卵丘細(xì)胞 （Cumulus cells，CCs）通過(guò)高度特異性的細(xì)胞質(zhì)突起穿過(guò)透明帶接近卵母細(xì)胞膜形成縫隙連接和細(xì)胞間橋等連接功能上的合胞體即卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體 （cumulus-oocyte complexs，COCs）[1]， CCs在卵母細(xì)胞周圍特殊的結(jié)構(gòu)組織有利于它們之間的持續(xù)相互作用。事實(shí)上，CCs為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)[2]如小分子物質(zhì)丙酮酸、氨基酸、核糖核苷等；支持卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟[3]，CCs維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯[4]。因此，CCs可以用研究卵母細(xì)胞成熟機(jī)制研究；CCs也可作為核移植良好的供體細(xì)胞[5]；也可用于探討某些因子或藥物對(duì)卵巢的作用機(jī)制[6]。本研究以牦牛的卵巢為材料，采集其卵泡中的COCs，進(jìn)行CCs分離原代改良培養(yǎng)，并對(duì)所得到的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以改良牦牛CCs的體外培養(yǎng)方法，為牦牛的卵母細(xì)胞成熟、CCs生物學(xué)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牦牛卵巢取自西寧屠宰場(chǎng)。DMEM/F-12、胎牛血清 （Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于Gibco公司；胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和DMSO等購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛卵丘細(xì)胞原代改良培養(yǎng)

將牦牛卵巢放在加有抗生素、溫度在35～37℃生理鹽水的保溫瓶中，并于4h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。使用12號(hào)針頭的10ml注射器從直徑2～6 mm的卵泡中回收COCs[7]。在體視顯微鏡下收集胞漿均一和至少3層完整致密的卵丘細(xì)胞COCs，進(jìn)行CCs的分離培養(yǎng)。隨后，用0.1%透明質(zhì)酸酶消化COCs，直到CCs與卵母細(xì)胞完全分離。體視顯微鏡下去除裸卵。CCs在1000r/min離心5min后，用磷酸鹽緩沖液 （PBS）洗滌2次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml，原代細(xì)胞在含有15%和10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液中37℃，5%CO2培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)液顏色橘紅色生長(zhǎng)良好，黃色則需要換液，一般原代前期每?jī)商鞊Q液一次，對(duì)數(shù)期開始每隔一天換液一次。

1.2.2 傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞匯合至90%時(shí)棄去培養(yǎng)液，先加入PBS約2～3ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，漂洗1～2次，用移液槍吸干PBS后加入胰蛋白酶消化液1ml，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使消化液沒(méi)過(guò)整個(gè)細(xì)胞層，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，應(yīng)立即吸棄消化液再根據(jù)細(xì)胞脫落情況選擇適當(dāng)干消化，當(dāng)大片細(xì)胞開始脫落時(shí)迅速加入2ml完全培養(yǎng)液終止消化。將消化后的細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，1000r/min離心3min，棄上清，再用PBS離心清洗2次，棄上清液在沉淀中加入完全培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml，細(xì)胞在10%FBS和1%青霉素/硫酸鏈霉素溶的含DMEM/F12培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃，5%CO2。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至90%左右進(jìn)行傳代或凍存。

1.2.3 牦牛卵丘細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

當(dāng)兩種原代培養(yǎng)的原代CCs匯合至90%時(shí)，分別用胰蛋白酶消化，密度為1×105的細(xì)胞懸液接種于24孔板0.5mL/孔37℃，5%CO2培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為第一天的細(xì)胞密度，之后每天在同一時(shí)間從24孔板用胰蛋白酶消化三孔細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后計(jì)算出細(xì)胞密度，三孔求平均值為當(dāng)天細(xì)胞密度。以培養(yǎng)天數(shù) （d）為橫坐標(biāo)，以當(dāng)天細(xì)胞密度 （×105個(gè)/ml）為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有驗(yàn)驗(yàn)至少重復(fù)3次，并使用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 牦牛的卵丘細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代

牦牛的CCs采用貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)。15%FBS培養(yǎng)的原代CCs（1×105個(gè)/ml）在接種到培養(yǎng)瓶或平皿中6～8h就有貼壁，12h后觀察到有少量細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，由圓形變成長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形，呈放射狀排列。3d時(shí)大部分貼壁細(xì)胞末端相互接觸，開始匯合，細(xì)胞形成叢生狀，細(xì)胞之間有大片間隙。4～5d時(shí)細(xì)胞之間空隙減少，相連成片，并排列成有序的束狀或帶狀。7～8d后細(xì)胞之間空隙消失，細(xì)胞排列緊密飽滿而有規(guī)則，鋪滿培養(yǎng)瓶的底部 （見圖1a）。15%FBS培養(yǎng)的原代細(xì)胞匯合成90%，即可進(jìn)行傳代 （1×105個(gè)/ml），細(xì)胞生長(zhǎng)有規(guī)律，形態(tài)穩(wěn)定多為梭形 （見圖1b），培養(yǎng)過(guò)程中可視培養(yǎng)液的顏色1～3d換一次培養(yǎng)液。以上述方法傳代可連續(xù)傳至15代以上細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定且不老化。而10%FBS培養(yǎng)的原代細(xì)胞形態(tài)形成細(xì)胞單層需要9～10d，細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定，出現(xiàn)不同生長(zhǎng)區(qū)域，相對(duì)平鋪不飽滿 （見圖1c），傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)不均一 （見圖1d）相同條件培養(yǎng)傳至第7～8代開始老化。

2.2 牦牛卵丘細(xì)胞二代生長(zhǎng)曲線

牦牛CCs生長(zhǎng)曲線基本上呈 “S”型 （見圖2～3）。15%FBS接種后，細(xì)胞經(jīng)歷2d的緩慢生長(zhǎng)的潛伏期，第3天細(xì)胞開始迅速生長(zhǎng)， 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 到第7天細(xì)胞開始發(fā)生接觸抑制，之后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢， 進(jìn)入平臺(tái)期 （見圖2）。10%FBS接種后，細(xì)胞經(jīng)歷3d的緩慢生長(zhǎng)的潛伏期，第4天細(xì)胞開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 到第8天細(xì)胞開始發(fā)生接觸抑制進(jìn)入平臺(tái)期 （見圖 3）。

3 討論

牦牛原代卵丘細(xì)胞 （1×105個(gè)/ml）接種后，隨著貼壁生長(zhǎng)形狀由圓形變成長(zhǎng)梭形或不規(guī)則三角形，呈放射狀排列而不是長(zhǎng)梭形或流線型，這與豬、牛的原代卵丘細(xì)胞形態(tài)一致[8，9]。但15%FBS培養(yǎng)細(xì)胞排列緊密飽滿而有規(guī)則，鋪滿培養(yǎng)瓶的底部，可傳至15代以上。10%FBS培養(yǎng)細(xì)胞相對(duì)平鋪不飽滿，成簇生長(zhǎng)，傳至7～8代就開始老化。相同培養(yǎng)條件觀察二代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以看出，原代10%FBS培養(yǎng)的二代第4天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)期相對(duì)平緩，第7天進(jìn)入平臺(tái)期。而原代15%FBS第3天就進(jìn)入對(duì)數(shù)期，對(duì)數(shù)期相對(duì)陡峭細(xì)胞活性較高，第7天進(jìn)入平臺(tái)期。這與牛顆粒細(xì)胞等生長(zhǎng)曲線相似[9]，比豬卵丘細(xì)胞[8]進(jìn)入平臺(tái)期少1d，這可能與物種有關(guān)。另外要獲得優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞還要注重細(xì)胞培養(yǎng)操作細(xì)節(jié)，在傳代培養(yǎng)時(shí)注意把握消化時(shí)間，先濕消化再干消化可最大程度減少消化液對(duì)細(xì)胞的傷害，適時(shí)更換培養(yǎng)液，減少機(jī)械化學(xué)損傷和污染發(fā)生，最大限度保證良好的培養(yǎng)條件，來(lái)獲得形態(tài)良好活性較高的卵丘細(xì)胞。

結(jié)果表明不同的原代培養(yǎng)條件可影響傳代細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律和質(zhì)量，牦牛卵丘細(xì)胞原代培養(yǎng)改良后，第二代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線“S”型，接種后，經(jīng)歷2d的潛伏期，第3d細(xì)胞開始迅速生長(zhǎng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞形態(tài)良好，到第7d細(xì)胞開始發(fā)生接觸抑制，進(jìn)入生長(zhǎng)緩慢的平臺(tái)期；細(xì)胞可傳至15代以上不老化，可用于建立牦牛卵丘細(xì)胞株。穩(wěn)定生長(zhǎng)形態(tài)良好的牦牛卵丘細(xì)胞可用于牦牛卵丘細(xì)胞生物學(xué)研究，為牦牛卵母細(xì)胞成熟機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。