HPLC波長切換法同時測定黃芩-甘草藥對中9種成分含量

彭勍，孟碩，苗蘭，林力，劉光宇，張鵬，劉建勛

HPLC波長切換法同時測定黃芩-甘草藥對中9種成分含量

彭勍，孟碩，苗蘭，林力，劉光宇，張鵬，劉建勛

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中澳中醫(yī)藥國際聯(lián)合研究中心，北京 100091

建立HPLC同時測定黃芩-甘草藥對中芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素含量的方法，探討黃芩-甘草配伍前后這9種主要成分含量變化規(guī)律。采用Phenomenex Synergi Polar-RP 80A色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，通過梯度洗脫和多波長切換技術(shù)，測定黃芩-甘草藥對配伍前后9種主要成分的含量。芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的線性范圍分別為0.032 5～1.040 0 μg（＝0.999 9）、0.050 9～1.630 0 μg（＝0.999 9）、0.007 8～0.248 0 μg（＝0.999 9）、0.436 9～13.980 0 μg（＝0.999 8）、0.040 3～1.290 0 μg（＝0.999 9）、0.078 4～2.510 0 μg（＝0.999 9）、0.025 4～0.812 0 μg（＝0.999 9）、0.085 6～2.740 0 μg（＝0.999 7）、0.004 3～0.139 0 μg（＝0.999 7）。黃芩和甘草配伍后，芹糖甘草苷含量升高（＜0.01），甘草苷含量降低（＜0.01），其他成分含量無明顯變化。本研究建立的方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可為黃芩-甘草藥對及其制劑的質(zhì)量評價和控制提供依據(jù)；黃芩-甘草配伍后部分成分含量發(fā)生變化。

黃芩；甘草；含量測定；高效液相色譜法；波長切換

藥對是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，臨床相對固定的2味中藥配伍，具有協(xié)同增效或配伍減毒作用，為中醫(yī)藥發(fā)展過程中的特色產(chǎn)物之一[1]。黃芩味苦，性寒，功效清熱燥濕、瀉火解毒[2]301；甘草味甘，性平，功效補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥[2]86。黃芩-甘草是常用配伍藥對，見于小柴胡片、芩連片等多種制劑中，多發(fā)揮清熱解毒作用。本課題組根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方，研發(fā)了具有宣肺平喘、祛風(fēng)止咳、清熱化痰功效的麻荊顆粒，主要用于外寒內(nèi)熱證的感冒后咳嗽、急性支氣管炎、慢性支氣管炎發(fā)作期等，由麻黃、黃芩、甘草、牡荊油組成，其中黃芩與甘草為1∶1配伍[3]。目前，針對黃芩-甘草藥對的配伍研究較少，對于黃芩和甘草配伍后主要化學(xué)成分的含量變化尚未見報道。因此，本試驗(yàn)建立HPLC多波長切換法同時測定黃芩-甘草藥對中芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素9種成分含量的方法，比較黃芩和甘草配伍前后主要成分的含量變化，為中藥復(fù)方配伍機(jī)制及黃芩-甘草藥對的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），MS205DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KH-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品黃芩苷、甘草苷（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110715-201720、111610-201005，純度均大于98%），芹糖甘草苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為MUST-18112701、MUST-19030102，純度均大于98%），異甘草苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素（上海詩丹德生標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號分別為6387、5014、5699、5559、5325，純度分別為99%、99%、98%、96%、98%）。乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司），磷酸（色譜純，F(xiàn)isher公司），其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈有限公司）。

3批黃芩（產(chǎn)地河北，批號1606011、1704012、1805011，編號為黃芩1、2、3）、3批甘草（產(chǎn)地新疆，批號1606012、1704011、1805022，編號為甘草1、2、3），購于河北百草康神藥業(yè)有限公司，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生藥標(biāo)本室何希榮藥師鑒定，分別為唇形科植物黃芩Georgi的干燥根和豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，品種、性狀均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）的有關(guān)規(guī)定，標(biāo)本存于本實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Synergi Polar-RP 80A柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，梯度洗脫程序見表1，波長切換（0 min，276 nm；30 min，360 nm；34 min，280 nm；45 min，352 nm；49 min，275 nm；62 min，237 nm；66 min，274 nm），進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，各成分均達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)均大于6000。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

時間乙腈0.1%磷酸水溶液 0 min1882 19 min1981 20 min2377 34 min2377 35 min2575 50 min2773 75 min5545

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液

分別取芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷和甘草酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇，配制成濃度分別為1.040、1.630、0.248、2.740 mg/mL的對照品貯備液；分別取黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度分別為13.980、1.290、2.510、0.812、0.139 mg/mL的對照品貯備液。精密吸取各對照品貯備液適量，置10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得每1 mL含芹糖甘草苷104.0 μg、甘草苷163.0 μg、異甘草苷24.8 μg、黃芩苷1398.0 μg、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷129.0 μg、漢黃芩苷251.0 μg、黃芩素81.2 μg、甘草酸274.0 μg和漢黃芩素13.9 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液及單味藥對照溶液

取黃芩、甘草粉末（過3號篩）各0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ?00 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取黃芩樣品粉末（過3號篩）0.1 g，精密稱定，按上法制備，即得黃芩對照溶液。取甘草粉末（過3號篩）0.1 g，精密稱定，按上法制備，即得甘草對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

取混合對照品溶液、供試品溶液、黃芩對照溶液和甘草對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，色譜圖見圖1。在供試品溶液色譜圖中，與混合對照品色譜圖的芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素相應(yīng)色譜峰位置上均有相同保留時間的色譜峰，而黃芩對照溶液中不含芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷和甘草酸的色譜峰，甘草對照溶液中不含黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的色譜峰，表明黃芩和甘草中的特征成分在此測定方法下不相互干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，逐級等倍稀釋，得6個濃度的混合對照品溶液，按上述色譜條件分別測定，以各成分濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程，結(jié)果見表2。芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素在各自的線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的峰面積RSD分別為1.19%、0.65%、0.14%、0.10%、0.04%、0.03%、0.10%、0.11%和0.14%，表明儀器精密度良好。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.黃芩對照；D.甘草對照；1.芹糖甘草苷；2.甘草苷；3.異甘草苷；4.黃芩苷；5.千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；6.漢黃芩苷；7.黃芩素；8.甘草酸；9.漢黃芩素

表2 9種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

成分回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍/μg 芹糖甘草苷Y＝11.23X＋5.8330.999 90.032 5～1.040 0 甘草苷Y＝16.42X＋17.990.999 90.050 9～1.630 0 異甘草苷Y＝39.34X＋7.1300.999 90.007 8～0.248 0 黃芩苷Y＝30.16X＋391.90.999 80.436 9～13.980 0 漢黃芩苷Y＝38.06X＋78.220.999 90.078 4～2.510 0 黃芩素Y＝60.18X＋29.710.999 90.025 4～0.812 0 甘草酸Y＝5.999X＋26.070.999 70.856 3～2.740 0 漢黃芩素Y＝56.20X＋9.6920.999 70.004 3～0.139 0 千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷Y＝16.34X＋17.960.999 90.040 3～1.290 0

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定各成分峰面積值，結(jié)果供試品溶液中芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的峰面積RSD分別為1.46%、1.55%、2.51%、0.08%、0.47%、0.28%、0.62%、0.13%和0.41%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次黃芩（批號1805011）、甘草（批號1805022）粉末各6份，每份0.1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，經(jīng)計算，樣品中芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的平均含量為8.724、10.01、1.560、140.6、14.59、27.29、3.630、22.95、1.407 mg/g，RSD分別為0.52%、2.48%、1.24%、1.23%、0.63%、0.75%、1.26%、0.62%和1.21%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批次黃芩（批號1805011）甘草（批號1805022）粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，分別精密加入與樣品中各成分等量的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率及RSD。結(jié)果芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的平均回收率分別為99.3%、101.3%、101.7%、101.7%、102.7%、103.1%、102.5%、98.9%和102.2%，RSD分別為2.89%、2.09%、2.18%、2.66%、2.72%、1.08%、2.75%、1.28%和1.31%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4 樣品含量測定

取3批黃芩、甘草樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，并計算各樣品中芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的含量，見表3。應(yīng)用檢驗(yàn)對黃芩、甘草配伍前后上述9種成分的含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示芹糖甘草苷含量升高（＜0.01），甘草苷含量降低（＜0.01），其他成分含量無明顯變化。

表3 3批黃芩、甘草樣品配伍前后9種成分含量測定結(jié)果（mg/mL）

成分 1 2 3 黃芩甘草黃芩-甘草 黃芩甘草黃芩-甘草 黃芩甘草黃芩-甘草 芹糖甘草苷－0.031 80.039 6 －0.017 60.023 7 －0.027 50.034 6 甘草苷－0.069 50.065 2 －0.049 70.047 9 －0.048 50.040 0 異甘草苷－0.011 90.011 2 －0.005 50.005 2 －0.006 40.006 4 黃芩苷0.596 7－0.530 6 0.544 0－0.522 3 0.565 8－0.557 4 千層紙素 A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.065 2－0.052 2 0.045 6－0.042 2 0.058 6－0.057 5 漢黃芩苷0.115 0－0.094 2 0.109 8－0.105 8 0.109 5－0.108 2 黃芩素0.014 8－0.012 7 0.015 2－0.015 4 0.014 1－0.014 3 甘草酸－0.103 60.103 7 －0.061 80.064 3 －0.092 70.091 5 漢黃芩素0.005 2－0.004 9 0.007 4－0.006 9 0.004 8－0.005 5

注：“－”為未檢出

3 討論

現(xiàn)代研究表明，黃芩具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗癌等藥理作用，黃酮類成分是其主要的藥效活性成分[4]。黃芩苷是其中含量最高的黃酮類活性成分，在黃芩根部含量為10.11%[5]。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素是黃芩的特征成分，是黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)性成分[6]。甘草具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降糖降壓的作用，主要含有黃酮類、皂苷類和多糖類化合物[7-8]。甘草酸是甘草中含量最高的三萜皂苷類成分，占總?cè)圃碥疹惢衔锏?%以上，具有抗過敏、抗炎、保護(hù)肝臟的作用[9]。黃酮類成分在甘草中的含量僅次于三萜皂苷類成分，甘草苷和異甘草苷為其中含量較高的代表性成分。結(jié)合實(shí)際測定結(jié)果與對照品獲得的難易程度，本研究最終確定以芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素9種成分作為指標(biāo)性成分進(jìn)行測定。

為保證提取效率，同時參考藥典和文獻(xiàn)[10-11]的提取方法，本試驗(yàn)應(yīng)用單因素考察法比較了不同提取溶劑（30%、50%、70%乙醇，純甲醇）、不同料液比（50、100、200、250倍），以及不同提取時間（30、45、50 min）對9種指標(biāo)成分含量的影響，最終確定了提取方法。

本試驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液不同流動相系統(tǒng)，以各色譜峰的峰形和分離度為指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，各色譜峰分離度和峰形良好，且基線平穩(wěn)。經(jīng)全波長掃描分析，芹糖甘草苷、甘草苷、異甘草苷、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸和漢黃芩素的最大吸收波長分別為254、276、360、280、325、275、280、237、274 nm，由此確定了波長切換程序，確保每個成分均在其最大吸收波長測定，檢測靈敏度更高。在色譜柱的選擇上，考察了Phenomenex Synergi Polar-RP 80A（4.6 mm×250 mm，4 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)前者各色譜峰分離度優(yōu)于后者，且峰形更美觀，故選用前者。

本試驗(yàn)通過波長切換技術(shù)，建立了HPLC同時測定黃芩-甘草藥對中9種主要成分含量的方法。結(jié)果顯示，黃芩-甘草配伍后，芹糖甘草苷含量有所增加，甘草苷含量有所降低，對黃芩的主要成分沒有影響。推測黃芩和甘草配伍可能增加了芹糖甘草苷的溶出，而甘草苷減少可能由于提取過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，或是與黃芩中的某些化學(xué)成分相互結(jié)合，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本方法穩(wěn)定準(zhǔn)確，可為黃芩-甘草藥對的內(nèi)在質(zhì)量評價提供參考，也可為含黃芩-甘草藥對的中藥制劑質(zhì)量評價和控制提供依據(jù)。

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Simultaneous Determination of Nine Components in Scutellariae Radix-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Pair by HPLC Wavelength Switching Method

PENG Qing, MENG Shuo, MIAO Lan, LIN Li, LIU Guangyu, ZHANG Peng, LIU Jianxun

To establish an HPLC method for simultaneous determination of liquiritin apioside, liquiritin, isoliquiritin, baicalin, papylamine A-7-O-β-D-glucuronide, wogonoside, baicalein, glycyrrhizic acid and wogonin in Scutellariae Radix - Glycyrrhizae Radix et Rhizoma pair; To study the law of content changes of the 9 components after compatibility.The separation was performed on Phenomenex Synergi Polar-RP 80A (4.6 mm × 250 mm, 4 μm) with mobile phase composed of acetonitrile- 0.1% phosphoric acid solution for gradient elution and with switching detection wavelength at the flow rate of 1.0 mL/min; the column temperature was controlled at 35 ℃, so as to determine the contents of main 9 components in Scutellariae Radix - Glycyrrhizae Radix et Rhizoma pair before and after compatibility.The linear ranges of liquiritin apioside, liquiritin, isoliquiritin, baicalin, papylamine A-7-O-β-D-glucuronide, wogonoside, baicalein, glycyrrhizic acid and wogonin were 0.032 5? 1.040 0 μg (=0.999 9), 0.050 9?1.630 0 μg (=0.999 9), 0.007 8?0.248 0 μg (=0.999 9), 0.436 9?13.980 0 μg (=0.999 8), 0.040 3?1.290 0 μg (=0.999 9), 0.078 4?2.510 0 μg (=0.999 9), 0.025 4?0.812 0 μg (=0.999 9), 0.085 6? 2.740 0 μg (=0.999 7), 0.004 3?0.139 0 μg (=0.999 7), respectively. After the compatibility, the content of liquiritin apioside increased (<0.01), and the content of liquiritin decreased (<0.01), while there was no significant change in the contents of other components.This method is stable and accurate, and can provide scientific basis for the quality evaluation and control of Scutellariae Radix - Glycyrrhizae Radix et Rhizoma pair and its preparations. The contents of some components changed in Scutellariae Radix - Glycyrrhizae Radix et Rhizoma pair after compatibility.

Scutellariae Radix; Glycyrrhizae Radix et Rhizoma; content determination; HPLC; wavelength switching

R284.1

A

1005-5304(2020)05-0065-05

10.3969/j.issn.1005-5304.201908413

北京市科技計劃“十病十藥”研發(fā)專項(xiàng)（Z171100001717007）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872992）；中國中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自主選題項(xiàng)目（ZZ11-068）

劉建勛，E-mail：liujx0324@sina.com

（2019-08-26）

（2019-09-23；編輯：陳靜）