小黑藥親電成分干預(yù)混合游離脂肪酸誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞株HepG2脂肪變性研究

董文樂(lè) - 蔣羽鴿 - 夏淑芳 - 曹叢叢 - 趙 蔚 成向榮 -

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝臟脂質(zhì)過(guò)量累積與細(xì)胞脂肪變性為主要特征的代表性疾病[1]。目前對(duì)于該病的內(nèi)在機(jī)制尚未，普遍接受的發(fā)病機(jī)制是Day等[2]提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)涉及了影響非酒精性脂肪肝發(fā)展的多種因素，其中細(xì)胞內(nèi)活性氧過(guò)多引起的氧化應(yīng)激是該病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素。氧化應(yīng)激可損傷線粒體內(nèi)脂肪酸β氧化相關(guān)酶，影響β氧化進(jìn)程，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)量累積，誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)生[3-4]。

當(dāng)機(jī)體內(nèi)生成過(guò)多活性氧時(shí)，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除自由基的能力下降，需要補(bǔ)充外源性抗氧化劑。外源抗氧化劑基于性質(zhì)及作用機(jī)制分為直接抗氧化劑和間接抗氧化劑，間接抗氧化劑可通過(guò)上調(diào)各種細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá)起到抗氧化作用，具有不易降解、半衰期長(zhǎng)以及不易促氧化的特點(diǎn)[5]。膳食源親電化合物是一類廣泛存在于日常膳食中，普遍具有α,β-不飽和羰基或環(huán)張力的間接抗氧化劑[6]，其可通過(guò)烷基化修飾Nrf2-Keap1信號(hào)通路中Keap1的半胱氨酸殘基使Nrf2擺脫Keap1的結(jié)合，釋放入核，促進(jìn)下游抗氧化物質(zhì)的表達(dá)[7]。研究已證實(shí)，生姜中的花姜酮[8]和胡蘿卜中的炔醇類化合物[9]可以修飾Keap1的半胱氨酸殘基激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路，促進(jìn)下游細(xì)胞保護(hù)性蛋白和抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。氧化應(yīng)激在非酒精性脂肪肝發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，筆者推測(cè)膳食源親電化合物是一類潛在的非酒精性脂肪肝干預(yù)因子。

小黑藥是菊科旋覆花屬植物顯脈旋覆花(InulanervosaWall.)的根莖[10]，于2010年被批準(zhǔn)為新食品原料。小黑藥具有抗氧化[11]、抑菌[12]等作用，還能通經(jīng)絡(luò)，祛風(fēng)除濕，健胃消食，祛痰止咳[13]，目前尚無(wú)其他功效的報(bào)道，小黑藥干預(yù)肝細(xì)胞脂肪變性的作用尚未明確。嚴(yán)嵐[14]21-61的研究結(jié)果表明顯脈旋覆花地上部分含有苯丙素類、二萜類、百里香酚類成分；賀安娜等[11]的研究結(jié)果表明顯脈旋覆花地下部分中多酚類和黃酮類成分的含量分別為1.3%～2.3%，0.018%～0.028%；張虹等[15]的研究結(jié)果表明顯脈旋覆花根中黃酮類成分的含量為1.0%～2.3%。此外，同屬近緣的旋覆花植物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性的親電性倍半萜內(nèi)酯類成分[16]，但目前關(guān)于小黑藥的化學(xué)成分，特別是親電化合物的研究較少，小黑藥干預(yù)肝細(xì)胞脂肪變性的作用尚未明確。

研究擬根據(jù)親電天然產(chǎn)物易與富電子的巰基發(fā)生親電加成的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)巰基功能化磁珠對(duì)小黑藥醇提物、各極性部位中的親電成分進(jìn)行靶向敲出，并基于游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞評(píng)價(jià)小黑藥親電成分對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的干預(yù)作用，以期為小黑藥功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2：中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；

小黑藥：2018年9月采自云南昆明梁王山；

DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液：美國(guó)Hyclone公司；

胎牛血清、胰酶和雙抗：美國(guó)Gibco公司；

活性氧檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液(弱)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司；

甘油三酯測(cè)定試劑盒、總膽固醇檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)定試劑盒、總谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

RNA easy Isolation Reagent：南京諾唯贊生物科技有限公司；

MonScriptTMRTIII All in One Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MonAmpTMFast SYBR?Green qPCR Mix(None ROX)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒：中國(guó)莫納生物科技有限公司；

油酸鈉：北京邁瑞達(dá)科技有限公司；

棕櫚酸鈉：上海麥克林生化科技有限公司；

尼羅紅：北京索萊寶科技有限公司；

無(wú)脂肪酸的牛血清白蛋白：上海翊圣生物科技有限公司；

羧基磁性瓊脂糖微球：上海英芮誠(chéng)生化科技有限公司；

其他化學(xué)藥品和試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱：Thermo BB15型，美國(guó)Thermo公司；

酶標(biāo)儀：BioTek Synergyh1型，美國(guó)biotek公司；

高效液相色譜儀：LC20A型，島津(上海)商貿(mào)有限公司；

質(zhì)譜儀：MALDI SYNAPT MS型，美國(guó)沃特世公司；

熒光分光光度計(jì)：F98型，中國(guó)上海棱光技術(shù)有限公司；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：Monad Selected q225型，中國(guó)莫納生物科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-501型，上海申順生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小黑藥提取與萃取 根據(jù)文獻(xiàn)[11,17]稍作改動(dòng)，具體如下：將小黑藥粉碎成粉末，與95%乙醇按1∶20(g/mL)混合，45 ℃超聲輔助提取30 min。過(guò)濾后收集上層清液，重復(fù)4次，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮蒸干得小黑藥醇提物浸膏。浸膏分散在蒸餾水中，按體積比1∶2依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取3次，分別獲得石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干。

1.2.2 GSH功能化磁珠的制備

(1)取適量羧基磁性瓊脂糖微球(體積分?jǐn)?shù)為10%)于離心管中，磁性分離去除上清液；分別加入去離子水、0.1 mol/L MES緩沖液后混勻洗滌，磁性分離去除上清液，加入適量MES緩沖液混合重懸磁珠；加入20 mg/mL 偶聯(lián)試劑EDC·HCl溶液，室溫振蕩30 min；加入1 mg/mL的MES緩沖液溶解的GSSG溶液，室溫振蕩混合12～16 h，磁性分離去除上清液；反應(yīng)結(jié)束后以20 mmol/L pH 7.4 PBS洗滌4次，以10 mg/mL的濃度儲(chǔ)存于4 ℃，即為GSSG功能化磁珠。

(2)取適量10 mg/mL GSSG功能化磁珠加入等體積4 mg/mL PBS緩沖液溶解的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液進(jìn)行反應(yīng)；磁性分離去除上清液后將磁珠用PBS緩沖液洗滌3～5次；洗滌后的磁珠分散于1 mL PBS緩沖液中，即為GSH功能化磁珠(GSH-MNPs)。

1.2.3 小黑藥親電成分的定量表征 配制梯度濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mg/mL甲萘醌甲醇溶液，各取5.0 mL加入到95.0 mL GSH功能化磁珠溶液中，室溫下振蕩孵育30 min后，磁性分離，棄去上清液，剩余磁珠快速分散于適量PBS緩沖液中，清洗3～5次后，加入100.0 mL 25.0 mg/mL的FITC溶液繼續(xù)孵育10 min后，在激發(fā)波長(zhǎng)469 nm，發(fā)射波長(zhǎng)523 nm，增益12檔條件下，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定上清液熒光值。根據(jù)甲萘醌濃度與上清液熒光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，以10 mg/mL的各極性萃取物的甲醇溶液作為待測(cè)樣品，檢測(cè)GSH功能化磁珠與各極性萃取物的甲醇溶液后FITC探針的熒光值，以表征各部位中親電成分的含量。

1.2.4 小黑藥親電成分的靶向敲出 取GSH功能化磁珠190 mL與10 mL，20 mg/mL的各極性部位萃取物溶液，室溫下反應(yīng)30 min，獲得親電成分敲出后的小黑藥石油醚部位(PE-H)、乙酸乙酯部位(AE-H)、水部位(W-H)樣品。另取190 μL PBS與10 μL，20 mg/mL的各極性部位萃取物溶液，相同條件下反應(yīng)，得到未被GSH功能化磁珠孵育后的上清液，得到石油醚(PE-Q)、乙酸乙酯部位(AE-Q)、水部位(W-Q)的對(duì)照樣品。

1.2.5 小黑藥AE和AEH的LC-MS分析 對(duì)GSH功能化磁珠處理前后的乙酸乙酯部位樣品AE和AEH離心濃縮至干，配制成1.0 mg/mL的甲醇溶液，過(guò)0.22 mm濾膜后待LC-MS分析。

(1)液相條件：色譜柱為BEH C18柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 mm)；柱溫45 ℃；進(jìn)樣量10 mL；流動(dòng)相：A為100%乙腈，B為 0.1%甲酸水溶液；體積流速0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)200～600 nm。洗脫條件為：0～20 min，5%～100%乙腈；20～25 min，100%乙腈；25～30 min，5%乙腈。

(2)質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(ESI)，掃描方式采用正、負(fù)離子模式。脫溶劑氣流速700 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；毛細(xì)管電壓3 000 V；錐孔電壓30 V；錐孔氣速50 L/h；離子源溫度100 ℃。

1.2.6 脂肪變性細(xì)胞模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)[18—19]的方法稍作改動(dòng)，具體如下：稱取一定量的油酸鈉和棕櫚酸鈉(摩爾比為2∶1)，75 ℃水浴直至完全溶解，配成一定濃度的游離脂肪酸(FFA)溶液，用含無(wú)脂肪酸的牛血清白蛋白(d-BSA)的PBS溶液稀釋，0.22 mm無(wú)菌濾膜過(guò)濾待用。FFA終濃度為1.2 mmol/L，d-BSA終濃度為1%，細(xì)胞共孵育24 h后，建立脂肪變性細(xì)胞模型。

1.2.7 細(xì)胞給藥分組

(1)對(duì)照組：含終濃度為1% d-BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(2)模型組：含終濃度為1% d-BSA +終濃度為1.2 mmol/L FFA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(3)各極性部位萃取物組：含終濃度為1% d-BSA +終濃度為1.2 mmol/L FFA +0.5，1.0，2.0 mg/mL PE-Q、AE-Q、W-Q的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(4)親電成分敲出后各極性部位萃取物組：含終濃度為1% d-BSA +終濃度為1.2 mmol/L FFA +0.5，1.0，2.0 mg/mL的PE-H、AE-H、W-H的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)脂滴累積水平測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法稍作改動(dòng)，具體如下：尼羅紅粉末溶于DMSO溶液中，配成1.0 mg/mL濃度下的尼羅紅染料溶液。取經(jīng)不同給藥處理的96孔板，棄原培養(yǎng)基，PBS清洗1次，加入尼羅紅染料溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中染色15 min，棄去尼羅紅染料，PBS清洗2次，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)550 nm的條件下，用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)相對(duì)脂滴含量。

1.2.9 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè) 取經(jīng)不同給藥處理的96孔板，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加入DCFH-DA熒光探針，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS清洗3次以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA探針，在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm的條件下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.10 細(xì)胞內(nèi)脂代謝、氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 將細(xì)胞接種于6孔板中，分組給藥孵育24 h后，每孔加入適量裂解液裂解細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞裂解液中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙二醛(MDA)、還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)，細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.2.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定相關(guān)基因表達(dá)

(1)RNA提?。簩?duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后接種于6孔板中，分組給藥孵育24 h后，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞樣本處理、樣本中RNA的提取和產(chǎn)物檢測(cè)。

(2)RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA：按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析：按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，內(nèi)參基因β-actin及目標(biāo)基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于GSH功能化磁珠定量表征小黑藥親電成分

為探究小黑藥親電成分對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性的干預(yù)作用，首先對(duì)小黑藥中的親電成分含量進(jìn)行表征。前期張瀟雨等[20]報(bào)道了以游離GSH為探針、甲萘醌為對(duì)照物的天然提取物中親電成分的定量方法，其檢測(cè)原理為親電性熒光探針FITC可以與反應(yīng)體系內(nèi)親電成分競(jìng)爭(zhēng)游離GSH，通過(guò)測(cè)定未結(jié)合FITC的熒光強(qiáng)度表征親電成分含量。試驗(yàn)以親和磁珠固定化的GSH代替游離GSH，建立天然提取物中親電成分的定量方法。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在0.3～1.2 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著甲萘醌濃度的增加，上清液的熒光值逐漸增加，熒光值與甲萘醌濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.979 1)，表明該方法可用于親電成分含量的測(cè)定。

小黑藥醇提物及其各極性部位萃取物經(jīng)GSH親和磁珠孵育后上清液的熒光值如圖1所示。結(jié)果顯示，樣品上清液的熒光值均高于空白樣品，各樣品熒光值順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?石油醚部位>小黑藥醇提物>水部位。表明小黑藥醇提物及其各極性部位萃取物均含有親電成分，小黑藥親電成分主要集中于乙酸乙酯部位。

圖1 不同濃度甲萘醌、小黑藥提取物與各極性部位萃取物的熒光值

Figure 1 Fluorescence intensity of different concentrations of menadione, extract and fractions ofXiaoheiyao

2.2 小黑藥親電成分對(duì)脂肪變性細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積與ROS生成的影響

基于FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞模型分別評(píng)價(jià)了小黑藥各極性萃取物經(jīng)GSH功能化磁珠靶向敲出親電成分前后的活性變化，結(jié)果如圖2、3所示。模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積量和ROS生成量顯著增加(P<0.05)，表明給予1.2 mmol/L的FFA成功誘導(dǎo)了HepG2細(xì)胞脂肪變性，結(jié)果與文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道一致。與模型組相比，不同濃度的小黑藥各極性萃取物可以濃度依賴性的降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積量和ROS生成量，其中以AE組效果最好。給予2.0 mg/mL AE，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積量由模型組的(640.8±41.4)%顯著降低至(316.1±37.1)%(P<0.05)，ROS生成量由模型組的(136.6±6.2)%顯著降低至(100.3±5.0)%(P<0.05)。而各極性萃取物中親電成分被靶向敲出后，各萃取物的降脂活性和抗氧化活性均出現(xiàn)了不同程度的下降，乙酸乙酯部位活性下降幅度最大。在2.0 mg/mL濃度下，乙酸乙酯部位親電成分被敲出后，AE抑制脂質(zhì)累積和降低ROS生成的能力顯著降低(P<0.05)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，小黑藥親電成分具有降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積和ROS生成的作用，乙酸乙酯部位的親電成分干預(yù)肝脂肪變性的效果最好，可能與乙酸乙酯部位中親電成分含量最高有關(guān)。

與對(duì)照組相比，### 表示P<0.001；與模型組相比，* 表示P<0.05，** 表示P<0.01，*** 表示P<0.001；磁珠孵育前后相比，& 表示P<0.05

圖2 小黑藥各極性部位萃取物親電成分對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響

Figure 2 Effect of electrophilic components from fractions ofXiaoheiyaoon lipid accumulation in FFA-induced HepG2 cells

試驗(yàn)結(jié)果顯示，小黑藥各極性部位萃取物經(jīng)GSH親和磁珠靶向敲出親電成分后仍具有降低脂肪變性細(xì)胞ROS生成的作用。賀安娜等[11]的研究表明顯脈旋覆花醇提物含有的黃酮、多酚類成分具有清除DPPH、ABTS及超氧陰離子自由基，提高D-半乳糖致衰小鼠肝臟、腎臟及血清抗氧化能力的作用，而多酚、黃酮類成分普遍不具有α,β-不飽和羰基的親電化合物特征基團(tuán)。因此，推測(cè)小黑藥各極性部位萃取物經(jīng)GSH親和磁珠靶向敲出親電成分后，可能是其中的多酚、黃酮類成分發(fā)揮了降低脂肪變性細(xì)胞ROS水平的作用。研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了小黑藥抗氧化活性成分的多樣性，除了多酚、黃酮類直接抗氧化劑，還含有親電性間接抗氧化劑。

2.3 乙酸乙酯部位親電成分對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞的干預(yù)作用

針對(duì)小黑藥親電成分含量最高、干預(yù)肝細(xì)胞脂肪變性最好的乙酸乙酯部位，進(jìn)一步探究了其對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞的脂代謝、氧化應(yīng)激的影響(圖4、5)。

與對(duì)照組相比，###表示P<0.001；與模型組相比，* 表示P<0.05，** 表示P<0.01，*** 表示P<0.001；磁珠孵育前后相比，& 表示P<0.05

圖3 小黑藥各極性部位萃取物親電成分對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS生成的影響

Figure 3 Effect of electrophilic components from fractions ofXiaoheiyaoon ROS generation in FFA-induced HepG2 cells

與對(duì)照組相比，### 表示P<0.001；與模型組相比，* 表示P<0.05，*** 表示P<0.001；磁珠孵育前后相比，& 表示P<0.05

Figure 4 Effect of electrophilic components from ethyl acetate fraction ofXiaoheiyaoon lipid metabolism in FFA-induced HepG2 cells

與對(duì)照組相比，## 表示P<0.01；與模型組相比，* 表示P<0.05，** 表示P<0.01，*** 表示P<0.001；磁珠孵育前后相比，& 表示P<0.05

圖5 小黑藥乙酸乙酯部位親電成分對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響

Figure 5 Effect of electrophilic components from ethyl acetate fraction ofXiaoheiyaoon redox state in FFA-induced HepG2 cells

如圖4所示，模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量顯著上升(P<0.05)；AE組、AEH組與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)TG和TC水平出現(xiàn)不同程度下降；AEH組細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量均高于相應(yīng)給藥濃度的AE組，給藥濃度為2 mg/mL時(shí)，AEH組細(xì)胞內(nèi)的TG含量與AE組相比顯著性降低(P<0.05)，但AEH組細(xì)胞內(nèi)TC含量與AE組相比沒(méi)有顯著性降低(P>0.05)。以上結(jié)果表明小黑藥乙酸乙酯部位的親電成分可降低脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)TG和TC的積累，并且降低TG積累活性優(yōu)于降低TC積累活性。

小黑藥親電成分對(duì)脂肪變性細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響結(jié)果如圖5所示。模型組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著上升(P<0.05)，而反映抗氧化能力的T-AOC、GSH/GSSG和抗氧化酶活力的SOD、CAT、GSH-px出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)；細(xì)胞給予不同濃度的AE和AEH后，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化還原水平均出現(xiàn)不同程度的改善；對(duì)比AE組與AEH組，特別是在2 mg/mL濃度下，除GSH-px外，親電成分靶向敲出前后細(xì)胞內(nèi)MDA、T-AOC、GSH/GSSG、SOD、CAT水平均具有顯著性差異(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，小黑藥乙酸乙酯部位親電成分通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)與抗氧化酶的水平，調(diào)節(jié)脂肪變性肝細(xì)胞的細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。

2.4 乙酸乙酯部位親電成分對(duì)氧化還原穩(wěn)態(tài)與脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激在NAFLD發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，如損傷線粒體的正常功能(包括線粒體呼吸鏈活性和脂肪酸β-氧化能力)[21]，致使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成與分解失衡[22]，最終導(dǎo)致細(xì)胞脂肪變性。膳食源親電成分是一類可通過(guò)上調(diào)Nrf2信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶表達(dá)的間接抗氧化劑[7]，具有潛在的NAFLD干預(yù)作用。在揭示小黑藥親電成分對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的脂代謝、氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)控的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了乙酸乙酯部位中親電成分對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響。

小黑藥乙酸乙酯部位親電成分對(duì)氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果如圖6所示。AE組與AEH組氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因Nrf2、NQO1、GCLC的表達(dá)具有顯著性差異(P<0.05)，HO-1的表達(dá)雖有差異，但并不顯著(P>0.05)，表明小黑藥乙酸乙酯部位中親電成分發(fā)揮抗氧化活性主要與Nrf2、NQO1、GCLC表達(dá)上調(diào)有關(guān)。已有研究表明HO-1、NQO1和GCLC在調(diào)控肝臟ROS水平方面發(fā)揮著重要的作用，且HO-1、NQO1和GCLC受Nrf2-Keap1通路調(diào)控[23]，其他抗氧化酶如SOD、CAT等也受到Nrf2-Keap1通路調(diào)控[24]，生姜中的花姜酮、蘿卜中的天然炔醇為天然親電化合物，均已被報(bào)道可通過(guò)激活Nrf2-Keap1通路調(diào)節(jié)下游抗氧化酶和二相解毒酶的表達(dá)[8-9]，提示小黑藥乙酸乙酯部位中親電成分發(fā)揮抗氧化活性可能與通過(guò)激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路進(jìn)而顯著上調(diào)NQO1、GCLC的表達(dá)有關(guān)。小黑藥乙酸乙酯部位親電成分對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果如圖7所示。AE組與AEH組細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)存在差異，其中脂質(zhì)合成相關(guān)基因SREBP1c、ACC1的表達(dá)差異顯著(P<0.05)、FAS的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，而脂質(zhì)氧化分解相關(guān)基因PPARα的表達(dá)差異顯著(P<0.05)、CPT1A的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，表明小黑藥乙酸乙酯部位親電成分主要通過(guò)降低脂質(zhì)合成相關(guān)基因和提高脂質(zhì)氧化分解相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂代謝水平。SREBP1c是肝臟主要調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，其下游涉及FAS、ACC1等基因的調(diào)節(jié)，已有研究[25]表明Nrf2可以負(fù)反饋SREBP1c、PPARα進(jìn)而影響下游脂合成基因的表達(dá)，亦有研究[26]指出Nrf2敲除鼠脂肪酸合成酶FAS和硬脂酰輔酶A去飽和酶SCD等脂質(zhì)合成相關(guān)酶表達(dá)水平明顯提高，提示小黑藥乙酸乙酯中的親電成分可能通過(guò)上調(diào)Nrf2的表達(dá)，下調(diào)SREBP1c和ACC1表達(dá)，降低脂質(zhì)過(guò)量合成，上調(diào)PPARα表達(dá)，增加脂質(zhì)氧化分解，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的累積。綜合上述研究結(jié)果，小黑藥親電成分可能通過(guò)激活Nrf2細(xì)胞信號(hào)途徑上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，同時(shí)抑制脂質(zhì)合成和促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解，從而調(diào)節(jié)FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和脂代謝異常。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

Figure 6 Effect of electrophilic components from ethyl acetate fractions ofXiaoheiyaoon expression of Nrf2 pathway related genes in FFA-induced HepG2 cells

2.5 小黑藥乙酸乙酯部位中親電成分分析

基于小黑藥各萃取部位中親電成分含量與活性的比較，選取親電成分含量最豐富、肝細(xì)胞脂肪變性干預(yù)作用最好的乙酸乙酯部位，采用LC-MS分析，比較親電成分靶向敲出前后質(zhì)譜的變化，從而表征乙酸乙酯部位中的親電成分，結(jié)果如圖8所示。對(duì)比正、負(fù)離子模式下的總離子流圖各峰形，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)變化的峰，對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間分別為4.03，7.49，7.87，8.44，9.93，16.98，19.93 min。分析其在正負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰，顯示1～7號(hào)離子流信號(hào)對(duì)應(yīng)的分子量分別為472，292，426，370，428，420，248。通過(guò)高分辨信號(hào)推導(dǎo)和前期小黑藥植物化學(xué)研究結(jié)果[14]23-56，推測(cè)2號(hào)峰為Nervolan B，3號(hào)峰為Nervoyan C，6號(hào)峰為Vanclevic acid methyl ester，7號(hào)峰為Tomentosin。其中Nervolan B和Tomentosin具有α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)，為親電化合物，而Nervoyan C和Vanclevic acid methyl ester具有丙烯醇結(jié)構(gòu)，為弱親電化合物。

字母不同表示差異性顯著(P<0.05)

Figure 7 Effect of electrophilic components from ethyl acetate fractions ofXiaoheiyaoon expression of lipid metabolism related genes in FFA-induced HepG2 cells

圖8 小黑藥乙酸乙酯部位經(jīng)GSH功能化磁珠孵育前后成分的總離子流圖

3 結(jié)論

針對(duì)小黑藥親電成分及其干預(yù)脂肪變性作用尚未明確的現(xiàn)狀，結(jié)合親電成分靶向敲出技術(shù)、體外肝細(xì)胞脂肪變性模型評(píng)價(jià)方法，研究發(fā)現(xiàn)小黑藥含有親電成分，主要分布在乙酸乙酯部位；小黑藥親電成分具有降低FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積、氧化應(yīng)激的作用，其中乙酸乙酯部位活性最佳，其活性機(jī)制為小黑藥親電成分通過(guò)激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路上調(diào)下游抗氧化、脂質(zhì)氧化分解基因的表達(dá)和下調(diào)脂合成基因的表達(dá)，小黑藥中親電化合物可以改善脂肪酸誘導(dǎo)的脂肪變性，其機(jī)制與抗氧化和脂代謝相關(guān)基因的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，通過(guò)LC-MS表征初步從乙酸乙酯部位中發(fā)現(xiàn)7個(gè)明顯變化的質(zhì)譜峰，這些質(zhì)譜峰對(duì)應(yīng)化合物的確切結(jié)構(gòu)尚未完全揭示，需要通過(guò)核磁共振等手段進(jìn)一步確定。