單糖對蓮子淀粉回生特性的影響

陳悅宇 - 歐雨嘉 - 曾紅亮 - 張 怡 鄭寶東 -

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350002)

蓮子是中國的特產(chǎn)經(jīng)濟作物，淀粉含量高達(dá)50%(干基)，尤其直鏈淀粉含量高，易于老化回生，嚴(yán)重影響蓮子產(chǎn)品的持水性、質(zhì)構(gòu)等品質(zhì)特性[4-5]。林鴛緣[6]研究葡萄糖和果糖等對蓮子淀粉糊化特性的影響，結(jié)果表明，與果糖相比，葡萄糖—淀粉體系的回生值更低，冷穩(wěn)定性更好。然而，目前葡萄糖和果糖對蓮子淀粉回生特性影響的研究鮮見報道。另外，淀粉回生的研究方法包括流變法、熱分析法、X射線以及光譜分析(如紅外光譜、核磁共振)等[7]29。其中，X射線、紅外光譜以及核磁共振技術(shù)能夠從結(jié)構(gòu)特性方面表征淀粉的回生程度，但是，這類技術(shù)很少應(yīng)用于糖類對淀粉回生影響的研究中。

試驗擬以蓮子淀粉為研究對象，采用X-射線衍射、核磁共振以及傅里葉紅外光譜研究單糖(葡萄糖和果糖)對蓮子淀粉晶體結(jié)構(gòu)、雙螺旋結(jié)構(gòu)以及短程有序結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)特性的影響，以探討葡萄糖和果糖對蓮子淀粉回生特性的影響，進(jìn)一步通過凝膠滲透色譜分析不同復(fù)合體系分子量的差異性，以期為糖類影響淀粉回生及其作用機理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮凍蓮：綠田(福建)食品有限公司，用于提取蓮子淀粉(參照Zhang等[8]的方法)；

葡萄糖、果糖：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

高壓滅菌器：SYQ-DSX-280B型，上海申安醫(yī)療機械廠；

數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-0ES型，濟南金光儀器設(shè)備制造有限公司；

單室真空包裝機：DZQ400/2D型，溫州市新達(dá)包裝機械有限公司；

搖擺式粉碎機：BZFS-04C型，西安寶正實業(yè)公司；

X-射線衍射儀：X’ Pert Pro MPD X型，荷蘭 Philips 儀器有限公司；

核磁共振光譜儀：AVIII 400 MHz WB型，德國Bruker公司；

傅里葉紅外光譜儀：Nicolet 360型，美國Thermo Nicolet公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 以蒸餾水為溶劑，分別配制5 g/100 mL葡萄糖和果糖水溶液，隨后添加10 g/100 mL 蓮子淀粉，并在室溫下混合攪拌30 min。以不添加單糖的蓮子淀粉為對照，攪拌均勻后裝于真空袋中，進(jìn)一步將蓮子淀粉及其單糖混合溶液置于沸水浴加熱預(yù)糊化處理2 min，隨即采用121 ℃壓熱處理溶液15 min，冷卻至室溫后，分別在4 ℃下貯藏0，1，7 d，所制備的回生樣品經(jīng)冷凍干燥、粉碎、過100目篩后，置于干燥器皿中待用。

樣品編號：RLS、RLS1、RLS7分別表示壓熱處理后未回生、回生1 d和7 d的蓮子淀粉；RLS+Glu0、RLS+Glu1、RLS+Glu7分別表示葡萄糖存在下壓熱處理后未回生、回生1 d和7 d的蓮子淀粉；RLS+Fru0、RLS+Fru0、RLS+Fru0分別表示果糖存在下壓熱處理后未回生、回生1 d和7 d的蓮子淀粉。

1.3.2 X射線衍射圖譜測定 所制備的蓮子淀粉回生樣品采用X-射線衍射儀進(jìn)行測定，參照Zeng等[9]的方法。測定條件：X-射線發(fā)生器管壓40 kV，電流30 mA，發(fā)射狹縫0.25 nm，銅Kα射線，掃描角度2θ5°～45°，掃描速度0.02°/min，掃描方式為連續(xù)掃描。數(shù)據(jù)采用Jade 5.0進(jìn)行處理，參照趙本山等[10]的研究方法分析結(jié)晶區(qū)、亞結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶度，計算公式：

(1)

(2)

(3)

式中：

Ps1——結(jié)晶區(qū)，%；

PS2——亞結(jié)晶區(qū)，%；

C——結(jié)晶度，%；

S1——結(jié)晶區(qū)面積；

S2——亞結(jié)晶區(qū)面積；

Sa——無定形區(qū)面積。

1.3.313C CP/MAS固體核磁波譜測定 取200～300 mg淀粉樣品采用13C CP/MAS固體核磁共振技術(shù)掃描，參照陳釧杰[11]的方法略作修改，試驗條件：13C共振頻率100.63 MHz，采集時間0.025 s，接觸時間1.8 ms，魔角旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速6 kHz。數(shù)據(jù)采用MestReNova軟件進(jìn)行處理。其中，淀粉無定形區(qū)的特征峰C4峰相對占比的計算公式：

(4)

式中：

PC4——C4峰相對占比，%；

SCi——Ci峰擬合的相對面積。

1.3.4 紅外光譜測定 采用傅立葉紅外光譜儀對所制備的蓮子淀粉回生樣品進(jìn)行掃描測定。將淀粉樣品和溴化鉀于105 ℃烘箱中干燥至衡重后，稱取20 mg淀粉樣品和1 000 mg 溴化鉀置于瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨均勻，壓片后紅外光譜掃描。測定條件：掃描波長400～4 000 cm-1、掃描次數(shù)32、分辨率4 cm-1[12]。

1.3.5 凝膠滲透色譜分析 采用凝膠滲透色譜分析樣品的分子量。精確稱取0.05 g樣品于50 mmol/L DMSO(LiBr)溶液中，定容至25 mL；將溶液90 ℃加熱并磁力攪拌2 h，隨后25 ℃攪拌24 h至樣品完全溶解，12 000×g離心20 min后取上清液過0.45 μm微孔濾膜即得進(jìn)樣樣品。測定條件：Shodex P851-806色譜柱，柱溫50 ℃；Water WISH-01進(jìn)樣器，進(jìn)樣量1 mL；Shodex RI-101示差檢測器，溫度38 ℃，波長664.1 nm；流動相含有50 mmol/L DMSO(LiBr)溶液，流速0.35 mL/min；折光指數(shù)增量dn/dc=0.066[13]。數(shù)據(jù)分析采用ASTRA 6.1軟件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 DPS 9.50數(shù)據(jù)分析軟件單因素方差分析LSD法分析數(shù)據(jù)差異，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖對蓮子淀粉X射線衍射圖譜的影響

無序的淀粉分子重結(jié)晶形成有序態(tài)結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象稱為淀粉回生，其重結(jié)晶過程可以通過X射線衍射進(jìn)行表征[14-15]。單糖(葡萄糖和果糖)對蓮子淀粉X射線衍射圖譜的影響如圖1所示。結(jié)果表明，未回生的蓮子淀粉在2θ為15.01°，17.04°，22.76°時出現(xiàn)強衍射峰，回生1 d和7 d時，蓮子淀粉在2θ為15.01°處的衍射峰遷移至14.71°，并且在2θ為19.68°，23.82°處均出現(xiàn)新增的弱衍射峰，表明回生的蓮子淀粉為B型晶體結(jié)構(gòu)[8]。添加葡萄糖和果糖后，未回生的蓮子淀粉主要衍射峰為2θ16.82°和19.52°；回生1 d和7 d時，復(fù)合物的衍射圖譜與單一的蓮子淀粉相似，其中葡萄糖與淀粉復(fù)合體系的衍射峰2θ23.86°在回生7 d時才出現(xiàn)，可能是因葡萄糖能夠抑制蓮子淀粉B-型晶體結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致的。

單糖對蓮子淀粉結(jié)晶度的影響，如表1所示。結(jié)果表明，蓮子淀粉的結(jié)晶度隨著回生時間的增加而增加(P<0.05)，回生0～1 d蓮子的淀粉結(jié)晶度增加幅度遠(yuǎn)大于回生1～7 d蓮子的。這可能是由淀粉短期回生和長期回生的速率的快慢引起的，其短期回生主要由直鏈淀粉的快速重結(jié)晶引起的，回生速率較快，通常十幾小時內(nèi)即可完成；而淀粉長期回生則是由支鏈淀粉的長期重結(jié)晶所致，回生速率較慢，回生時間以天計，甚至長達(dá)幾周以上[16]。

添加葡萄糖后，蓮子淀粉的結(jié)晶度顯著低于單一的蓮子淀粉，回生1 d后蓮子淀粉的重結(jié)晶速度便顯著降低，回生1 d和7 d樣品間結(jié)晶度的差異不顯著(P>0.05)。

圖1 單糖對蓮子淀粉X射線衍射圖譜的影響

表1 單糖對蓮子淀粉結(jié)晶度的影響?

? 小寫字母不同代表不同樣品同一貯藏時間的相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；大寫字母不同代表同一樣品不同貯藏時間的相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。

同樣，添加果糖后，蓮子淀粉的結(jié)晶度顯著低于單一的蓮子淀粉，但其作用效果弱于葡萄糖，回生1 d和7 d樣品間結(jié)晶度的差異顯著(P<0.05)。由此說明，葡萄糖和果糖均能抑制蓮子淀粉重結(jié)晶從而延緩淀粉回生，葡萄糖抑制淀粉回生作用的效果高于果糖。該結(jié)果與馬紅靜[17]的研究報道相似，從糊化和質(zhì)構(gòu)特性分析，小分子糖對糯米淀粉凝膠老化的抑制效果為海藻糖>蔗糖>葡萄糖>果糖。目前普遍認(rèn)為，糖類對淀粉回生的抑制作用可能在于：① 糖分子與淀粉分子鏈的相互作用能夠穩(wěn)定淀粉基質(zhì)，延緩淀粉重結(jié)晶；② 糖分子與水分子之間的相互作用，影響淀粉重結(jié)晶所需的水分子，從而抑制淀粉回生[1,18]。葡萄糖對蓮子淀粉結(jié)晶區(qū)(由結(jié)晶線度較大的高級微晶構(gòu)成)和亞結(jié)晶區(qū)(結(jié)晶線度較小的初級微晶)均有顯著的抑制效果(P<0.05)，而果糖對蓮子淀粉結(jié)晶區(qū)形成的抑制作用較弱，甚至對長期回生蓮子淀粉的結(jié)晶區(qū)形成影響不顯著(P>0.05)，可能是葡萄糖和果糖影響蓮子淀粉回生差異的原因之一。另外，葡萄糖和果糖影響蓮子淀粉回生差異也可能是由不同類型糖分子與水分子間相互作用引起的。葡萄糖和果糖分子上平伏羥基可以與相鄰的水分子形成氫鍵作用，其平伏羥基數(shù)目分別為4.56和2.62[19-20]。這使得葡萄糖與水分子間相互作用高于果糖與水分子間的，阻礙水分子的運動，可能導(dǎo)致葡萄糖—淀粉體系中重結(jié)晶所需的水分減少，引起體系中淀粉回生程度較低。此外，研究[6]表明，葡萄糖和果糖引起蓮子淀粉體系黏度增加，葡萄糖的增黏作用較小，顯示了更好的穩(wěn)定性。由此可見，體系黏度的變化也可能是影響淀粉回生的關(guān)鍵因素。

2.2 單糖對蓮子淀粉固體核磁共振波譜的影響

采用13C CP/MAS固體核磁共振波譜分析單糖對蓮子淀粉分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，蓮子淀粉及其單糖復(fù)合物的核磁共振波譜相似，回生時間對蓮子淀粉核磁共振波譜的影響主要在于C1區(qū)106～96的化學(xué)位移(詳見表2)。淀粉核磁共振波譜C1區(qū)可以反映其晶體類型，A-型晶體在102，101，100 處出現(xiàn)3個峰；B-型晶體在101，100處出現(xiàn)2個峰；C-型晶體結(jié)構(gòu)由A-型和B-型晶體構(gòu)成，可表現(xiàn)為雙峰或者三峰，取決于不同類型晶體含量的高低[21-22]。對于C型晶體結(jié)構(gòu)的蓮子原淀粉而言，其C1振動區(qū)在101.60，100.35，99.60處出現(xiàn)3個峰[23]。壓熱法處理后未回生的蓮子淀粉在C1區(qū)3重結(jié)晶峰結(jié)構(gòu)消失，在103.09出現(xiàn)振動峰，而104～102出現(xiàn)C1的多樣性峰可能與晶體區(qū)的單螺旋結(jié)構(gòu)或無定型區(qū)的分布有關(guān)[24-25]。說明壓熱處理嚴(yán)重破壞了蓮子淀粉的晶體結(jié)構(gòu)，具有單螺旋結(jié)構(gòu)的直鏈淀粉分子浸出，淀粉分子處于無序態(tài)?；厣鷷r間的增加至1 d，蓮子淀粉在C1區(qū)的振動峰103.09偏移至102.95處，在101.22，100.02處出現(xiàn)新增的B-型晶體的特征振動峰，說明在冷藏過程中蓮子淀粉分子重結(jié)晶(回生)形成B-型晶體結(jié)構(gòu)?；厣? d時，C1區(qū)峰位發(fā)生一定的偏移但無新增振動峰，分別為102.78，101.11，100.05，說明回生時間并未影響蓮子淀粉的晶體結(jié)構(gòu)類型。

與單一的蓮子淀粉相比，添加葡萄糖和果糖時未回生的蓮子淀粉在C1區(qū)除了新增103.10附近振動峰，還分別保留了B型晶體結(jié)構(gòu)在100.33和99.69處的振動峰。說明葡萄糖和果糖可在一定程度上保護(hù)蓮子淀粉晶體結(jié)構(gòu)不被高溫破壞。張珊等[2]在小分子糖對木薯淀粉晶體結(jié)構(gòu)和糊化特性影響的研究中也發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和果糖能夠穩(wěn)定淀粉的結(jié)晶區(qū)，引起淀粉糊化溫度和糊化焓提高。淀粉的C4區(qū)可以反映其無定形區(qū)含量的高低，對比不同單糖對蓮子淀粉C4峰相對占比PC4的影響，如表2所示，隨著回生時間的增加，蓮子淀粉的PC4增加顯著降低(P<0.05)，表明隨著淀粉回生其結(jié)晶度增加，無定形區(qū)占比減少。與單一的蓮子淀粉相比，葡萄糖和果糖導(dǎo)致蓮子淀粉的PC4增加(P<0.05)，且葡萄糖的作用效果高于果糖；說明葡萄糖和果糖添加尤其是葡萄糖能夠使得蓮子淀粉無定形區(qū)含量增加，與其結(jié)晶區(qū)和亞結(jié)晶區(qū)占比減少有關(guān)，與X射線衍射測定的結(jié)果相一致。

圖2 單糖對蓮子淀粉13C CP/MAS固體核磁波譜的影響

表2 單糖對蓮子淀粉化學(xué)位移與C4峰相對占比的影響?

? 小寫字母不同代表不同樣品同一貯藏時間的數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；大寫字母不同代表同一樣品不同貯藏時間的數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。

2.3 單糖對蓮子淀粉紅外光譜的影響

采用傅里葉紅外光譜研究單糖對蓮子淀粉分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，葡萄糖和果糖添加后蓮子淀粉紅外光譜與單一蓮子淀粉的相似，沒有發(fā)現(xiàn)差異性特征峰，說明葡萄糖和果糖對蓮子淀粉的改性屬于物理改變。

對于淀粉的紅外光譜，波譜帶1 047 cm-1吸收峰對淀粉的晶體結(jié)構(gòu)十分敏感，1 022 cm-1吸收峰與淀粉的無定形結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，1 047，1 022 cm-1吸收峰強度的比值R1 047/1 022能夠反映淀粉的晶體結(jié)構(gòu)(短程有序結(jié)構(gòu))，被認(rèn)為與淀粉老化程度密切相關(guān)[26-27]。單糖對蓮子淀粉R1 047/1 022值影響的結(jié)果如表3所示，結(jié)果顯示：隨著回生時間的增加，蓮子淀粉及其單糖復(fù)合物的R1 047/1 022值顯著提高(P<0.05)，是由于淀粉回生引起體系短程有序結(jié)構(gòu)的增加。添加葡萄糖和果糖后，蓮子淀粉復(fù)合體系的R1 047/1 022值顯著降低(P<0.05)，葡萄糖—蓮子淀粉體系的R1 047/1 022值相較于果糖—蓮子淀粉體系更低。該結(jié)果與X射線衍射測定的結(jié)晶度和核磁共振測定的PC4結(jié)果相一致，表明葡萄糖和果糖能夠抑制蓮子淀粉短程有序結(jié)構(gòu)的形成，延緩淀粉老化程度，相比之下葡萄糖的抑制作用更佳。正如2.1中所論述的，葡萄糖和果糖對淀粉回生抑制作用的強弱的原因與其和水分子間相互作用的差異有關(guān)。張曉宇[7]35對于小分子糖(海藻糖、蔗糖和葡萄糖)影響木薯淀粉紅外光譜的研究結(jié)果顯示，同樣冷藏條件下的R1 047/1 022值大小順序如下：不含糖淀粉膠>含葡萄糖淀粉膠>含蔗糖淀粉膠>含海藻糖淀粉膠，表明海藻糖、蔗糖和葡萄糖均能抑制木薯淀粉的老化，且抑制能力依次減小，與三者所帶的平伏羥基數(shù)目不同(海藻糖8.00個，蔗糖6.30個，葡萄糖 4.56個)有關(guān)。

圖3 單糖對蓮子淀粉紅外光譜的影響

表3 單糖對蓮子淀粉分子有序結(jié)構(gòu)R1 047/1 022與R995/1 022值的影響?

Table 3 Effects monosaccharide on the ordered structure ofR1 047/1 022andR995/1 022values of lotus seed starch

樣品R1047/1022R995/1022RLS00.987±0.001aC0.978±0.003aCRLS10.997±0.003aB0.982±0.003aBRLS71.013±0.001aA0.991±0.003aARLS+Glu00.961±0.001cC0.911±0.011cCRLS+Glu10.985±0.003cB0.943±0.010cBRLS+Glu70.994±0.002cA0.951±0.007bARLS+Fru00.973±0.004bC0.959±0.007bCRLS+Fru10.991±0.001bB0.977±0.001bBRLS+Fru71.003±0.001bA0.985±0.003aA

? 小寫字母不同代表不同樣品同一貯藏時間的相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05；大寫字母不同代表同一樣品不同貯藏時間的相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)差異顯著，P<0.05。

波譜帶995 cm-1則與 C-6處羥基的分子內(nèi)氫鍵有關(guān)，能夠反映水合晶體的吸收振動[26]。相較于R1 047/1 022，995，1 022 cm-1吸收峰強度的比值R995/1 022值更能夠反映淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)[8,28]。單糖對蓮子淀粉R995/1 022值影響的結(jié)果與R1 047/1 022值相似(詳見表3)，蓮子淀粉R995/1 022值隨著回生時間的增加而增加(P<0.05)，表明體系中淀粉分子鏈回生過程中重組形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。除了回生7 d的蓮子淀粉與果糖復(fù)合體系，蓮子淀粉與葡萄糖、果糖復(fù)合體系的R995/1 022值均低于單一的蓮子淀粉(P<0.05)。說明葡萄糖和果糖能夠抑制蓮子淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成，果糖對長期回生過程中蓮子淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成無明顯的抑制作用，與其對淀粉回生程度的影響高度一致。

2.4 單糖對蓮子淀粉分子量的影響

采用凝膠滲透色譜分析單糖對蓮子淀粉分子量的影響，結(jié)果如表4所示。添加葡萄糖后，蓮子淀粉復(fù)合物的分子量Mw、Mn以及分散系數(shù)Mw/Mn均高于單一的蓮子淀粉。一般地，高分子量淀粉鏈在空間上重聚合成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)的難度高于低分子量淀粉鏈，使得低分子量淀粉鏈比高分子量淀粉鏈更易于回生[29]。基于此，推測葡萄糖與水分子的相互作用，葡萄糖添加引起蓮子淀粉分子量的增大也是其抑制回生的關(guān)鍵因素。添加果糖后，蓮子淀粉復(fù)合物的分子量Mw、Mn以及分散系數(shù)Mw/Mn均低于單一的蓮子淀粉，可能是上述紅外R995/1 022值結(jié)果中果糖對長期回生過程中蓮子淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成無明顯的抑制作用的因素之一。理論上，蓮子淀粉—果糖復(fù)合體系中低分子鏈淀粉鏈相比于單一的蓮子淀粉更易于回生。然而，試驗結(jié)果顯示，這種低分子量特性對于該體系淀粉回生的影響并不占主導(dǎo)作用，具體的原因有待進(jìn)一步研究。

表4 單糖對蓮子淀粉分子量的影響?

Table 4 Effects monosaccharide on the molecular weight of lotus seed starch

樣品Mn/DaMw/DaMw/MnRLS06.001×1061.485×1072.475RLS11.034×1072.139×1072.069RLS71.152×1072.883×1072.502RLS+Glu09.781×1062.477×1072.532RLS+Glu19.656×1063.106×1073.217RLS+Glu71.249×1073.285×1072.630RLS+Fru04.748×1061.031×1072.171RLS+Fru17.459×1061.438×1071.928RLS+Fru79.029×1062.104×1072.330

?Mn數(shù)均分子量，Mw重均分子量，Mw/Mn分子的多分散指數(shù)。

3 結(jié)論

基于結(jié)構(gòu)特性的分析結(jié)果表明葡萄糖和果糖對壓熱處理下蓮子淀粉的晶體結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，同時能夠抑制回生過程中蓮子淀粉重結(jié)晶、分子雙螺旋結(jié)構(gòu)和短程有序結(jié)構(gòu)的形成，表現(xiàn)出良好的抗老化能力。葡萄糖和果糖抑制淀粉回生的效果為葡萄糖>果糖，可能不同類型糖分子與水分子間相互作用的差異以及葡萄糖促進(jìn)淀粉分子量增加等因素有關(guān)。在老化過程中單糖與蓮子淀粉相互作用的機制尚未明確，未來可以通過分子模擬技術(shù)開展相關(guān)的研究。