水蒸氣蒸餾-鹽析法提取金銀花揮發(fā)油工藝研究

顧 珂，王 興，胡鵬宇，李海剛，王海燕，王 雪

(臨沂大學，山東 臨沂 276000)

金銀花味甘、性寒，具有清熱解毒、涼散風熱的功能，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。金銀花所含有的揮發(fā)油是其藥理活性的重要組成部分，具有清咽、解熱、化痰、平喘等功效[2]，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝、香料等領(lǐng)域[3]，目前上市的中藥制劑中，金銀花露[4]及金銀花合劑系通過水蒸氣蒸餾法制得，主要為金銀花中的揮發(fā)油類成分，臨床上用于暑熱口渴，熱癤瘡毒。金銀花揮發(fā)油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法[5]及超臨界流體萃取法[6]，超臨界流體萃取法單次處理量較小，且對設(shè)備要求高，水蒸氣蒸餾法更為適合工業(yè)化生產(chǎn)，但是金銀花揮發(fā)油含量低，水蒸氣蒸餾過程中，部分揮發(fā)性成分溶解于水中，導致金銀花揮發(fā)油提取率更低，為此，本文采用鹽析法降低金銀花揮發(fā)性成分在水中的濃度，結(jié)合水蒸氣蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油，進一步采用效應(yīng)面優(yōu)化法對水蒸氣蒸餾鹽析法提取金銀花揮發(fā)油的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，為工業(yè)化提取金銀花揮發(fā)油提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高速中藥粉碎機(濰坊星悅清城機械有限公司)；揮發(fā)油測定器(泰興市銘泰科教儀器設(shè)備有限公司)；數(shù)顯恒溫油浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；

1.2 材料

金銀花(臨沂市平邑縣)；乙醚為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花揮發(fā)油提取流程

參照揮發(fā)油測定法甲法(2015版藥典)提取揮發(fā)油并進行改進，具體方法如下：稱取金銀花置燒瓶中，加適量水振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時為止。置油浴鍋緩緩加熱至沸，提取過程始終保持微沸狀態(tài)，提取結(jié)束，停止加熱，放置，冷卻，自揮發(fā)油測定器上端加入適量乙醚溶解揮發(fā)油，分取乙醚層置已知重量的蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醚，稱取揮發(fā)油重量，計算揮發(fā)油提取率。

2.2 單因素考察

2.2.1 金銀花粉碎程度對揮發(fā)油提取率的影響 分別取未粉碎金銀花、切段金銀花、30～40目金銀花細粉、20～30目金銀花細粉各100 g，分別加15倍量純化水浸泡1 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，提取時間7 h，計算揮發(fā)油提取率。不同粉碎程度對揮發(fā)油提取率的影響如圖1所示。

圖1 粉碎度對揮發(fā)油提取率的影響

由圖1可見，隨金銀花粒度的減小，揮發(fā)油提取率有降低的趨勢，本實驗選用未粉碎金銀花進行揮發(fā)油提取。

2.2.2 加水量對揮發(fā)油提取率的影響 取金銀花100 g，分別加入10倍、15倍、20倍、25倍純化水浸泡1 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，提取時間7 h，計算揮發(fā)油提取率。加水量對揮發(fā)油提取率的影響如圖2所示。

圖2 加水量對揮發(fā)油提取率的影響

由圖2可見，隨加水量的增加，揮發(fā)油提取率顯著增加，加水量達到15倍后，繼續(xù)增加用水量，揮發(fā)油提取率增加不明顯。

2.2.3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響 取金銀花100 g，加入15倍量純化水浸泡1 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，分別提取1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h，計算揮發(fā)油提取率。提取時間對揮發(fā)油提取率的影響如圖3所示。

圖3 提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

由圖3可見，隨提取時間的延長，揮發(fā)油提取率明顯增加，提取時間增加到7 h后，隨提取時間延長，揮發(fā)油提取率變化不明顯。

2.2.4 浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響 取金銀花100 g，分別加入15倍量純化水浸泡0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，按照“2.1”項下方法提取揮發(fā)油，計算揮發(fā)油提取率。浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響如圖4所示。

圖4 浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響

由圖4可見，浸泡時間對揮發(fā)油提取率影響不大，浸泡1 h后隨浸泡時間的延長，揮發(fā)油提取率基本保持不變。本實驗選擇浸泡時間為1 h。

2.2.5 氯化鈉濃度對揮發(fā)油提取率的影響 稱取金銀花5份，每份100 g，分別用純化水，3%、5%、7%、10%氯化鈉溶液1 500 mL浸泡1 h，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端分別加入純化水，1%、3%、5%、7%、10%的氯化鈉溶液，充滿至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止。緩緩加熱至沸，提取過程始終保持微沸狀態(tài)，當揮發(fā)油測定器中液面上升至滿量程刻度部分時，開啟活塞使液面上端下降至揮發(fā)油測定器刻度0線上面5 mm 處為止，再從冷凝管上端通過導管分別緩緩加入水或不同濃度的氯化鈉溶液至液面上升至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止，如此反復直至提取結(jié)束，提取時間7 h。提取結(jié)束后，停止加熱，放置，冷卻，自揮發(fā)油測定器上端加入適量乙醚溶解揮發(fā)油，分取乙醚層，置已知重量的蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醚，稱取揮發(fā)油重量，計算揮發(fā)油提取率。鹽析液濃度對揮發(fā)油提取率的影響見圖5。

由圖5可見，隨氯化鈉濃度的升高，揮發(fā)油提取率顯著增加，氯化鈉濃度達到3%時，隨氯化鈉濃度的增加，揮發(fā)油提取率增加趨于緩慢。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化[7-8]金銀花揮發(fā)油提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素試驗的基礎(chǔ)

圖5 氯化鈉濃度對揮發(fā)油提取率的影響

上，選擇對揮發(fā)油提取率影響較大的3個因素：加水量(A)、提取時間(B)及氯化鈉濃度(C)為考察因素，每個因素選擇3個水平，采用3因素3水平Box-Behnken試驗設(shè)計，按照“2.2.5”項下方法，以揮發(fā)油提取率作為考察指標開展實驗。因素水平見表1，響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

2.3.2 模型評價 利用Design-Expert 軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得到的數(shù)學模型為：y=1.43-0.005 75A+0.020B+0.10C+0.013AB+0.001 5AC+0.003 25BC-0.013A2+0.031B2-0.087C2；R2=0.968 4。模型方差分析結(jié)果和各項系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果列于表3，變異系數(shù)見表4。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平表

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

表3 二次多項模型方差分析

表4 變異系數(shù)

由表3及表4可知：失擬項P值為0.115 4>0.05，表明該模型擬合中，非正常誤差所占比例小，擬合度高；回歸模型的F=28.83，P=0.000 2<0.05，表明實驗所采用的二次模型是顯著的，在統(tǒng)計學上是有意義的，決定系數(shù)R2=0.968 4，說明該模型能解釋96.84%響應(yīng)值變化，表明該回歸方程可很好對響應(yīng)值的變化進行擬合，擬合度好。

因素C(氯化鈉濃度)的P值<0.000 1，說明因素C對提取率的影響是極顯著的。因素B2的P值=0.036 2<0.05，因素C2的P值=0.000 2<0.05，說明因素B2、C2對提取率具有顯著影響。因素A、B、AB、AC、BC、A2的P值均大于0.05，說明以上因素對提取率沒有顯著影響。

2.3.3 響應(yīng)面分析 由圖6 可以看出，在固定加水量和提取時間時，揮發(fā)油提取率隨氯化鈉濃度的增加顯著增大，表明氯化鈉濃度對揮發(fā)油提取率影響顯著。當固定氯化鈉濃度時，提取率受加水量及提取時間的影響較小，揮發(fā)油提取率隨提取時間延長增加緩慢，隨加水量的增多，提取率呈凸型曲面變化，說明加水量過多對揮發(fā)油提取不利。

通過最優(yōu)化分析，最佳的提取條件為加水量21.59倍、浸泡1 h、提取時間11 h、氯化鈉濃度8.67%，預測提取率為1.518 99‰。根據(jù)實際情況，將加水量調(diào)整為20倍，浸泡時間為1 h，提取時間7 h，氯化鈉濃度8.5%。

圖6 三因素對揮發(fā)油提取率的效應(yīng)面及等高線：A(提取時間和加水量)；B(氯化鈉濃度和加水量)；C(提取時間和氯化鈉濃度)

2.4 驗證實驗

稱取金銀花100 g，加8.5%氯化鈉溶液2 000 mL浸泡1 h，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加入8.5%的氯化鈉溶液，充滿至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止。置油浴鍋緩緩加熱至沸，提取過程始終保持微沸狀態(tài)，當揮發(fā)油測定器中液面上升至滿量程刻度部分時，開啟活塞使液面上端下降至揮發(fā)油測定器刻度0線上面5 mm處為止，再從冷凝管上端通過導管緩緩加入8.5%的氯化鈉溶液至液面上升至揮發(fā)油測定器的1/2刻度部分為止，如此反復直至提取結(jié)束。提取結(jié)束后，停止加熱，放置，冷卻，自揮發(fā)油測定器上端加入適量乙醚溶解揮發(fā)油，分取乙醚層置已知重量的蒸發(fā)皿中，自然揮干乙醚，稱取揮發(fā)油重量，計算揮發(fā)油提取率。結(jié)果三批揮發(fā)油提取率分別為1.497 3‰、1.501 6‰、1.500 7‰，平均提取率為1.499 8‰。

3 討論

金銀花中揮發(fā)油含量較低，而水蒸氣蒸餾法提取金銀花揮發(fā)油時，部分揮發(fā)性物質(zhì)溶于水中，致使揮發(fā)油提取率更低。中國藥典2015版采用加入氯化鈉的方法降低金銀花揮發(fā)性物質(zhì)在金銀花露中的溶解度[4]，進一步通過水蒸氣蒸餾的方法提取金銀花露中的揮發(fā)性物質(zhì)進行質(zhì)量控制。本文將此方法用于金銀花揮發(fā)油的提取，探索水蒸氣蒸餾鹽析法各工藝參數(shù)與揮發(fā)油提取率的關(guān)系，優(yōu)選工藝參數(shù)。

以金銀花揮發(fā)油提取率為指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法探索金銀花揮發(fā)油提取工藝參數(shù)，經(jīng)方差分析表明擬合度較好，模型優(yōu)選的最佳提取工藝為加

水量為21.59倍、浸泡1 h、提取時間11 h、氯化鈉濃度8.67%，預測提取率為1.518 99‰，考慮實際提取時，各參數(shù)難以控制到模型優(yōu)選的精密度，同時考慮耗能情況，將工藝參數(shù)調(diào)整為加水量20倍、浸泡時間1 h，提取時間7 h、氯化鈉濃度8.5%。在此條件下?lián)]發(fā)油平均提取率為1.499 8‰。