基于藥代動(dòng)力學(xué)的山豆根抗炎作用機(jī)制研究

航 艾，孫 杰，盛云華，寧 煉，唐黎明,金若敏

(1.上海市食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室/藥物安全評(píng)價(jià)中心，2.上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203)

山豆根(Radix etRhizomeSophoraeTonkinensis, RRST)，為豆科植物越南槐(SophoratonkinensisGane)的干燥根和根莖，主要產(chǎn)于廣西和貴州等地，其運(yùn)用歷史已超過(guò)千年。山豆根藥性苦寒，有毒，歸肺、胃經(jīng)，功效清熱解毒，消腫利咽[1]，具有較好的抗炎作用?；瘜W(xué)成分分析結(jié)果表明，山豆根主要含有苦參堿(matrine)及氧化苦參堿(oxymatrine)等生物堿[2]，已有文獻(xiàn)報(bào)道山豆根對(duì)小鼠耳腫脹可以顯著抑制急性炎癥引起的毛細(xì)血管通透性增高、炎性滲出及組織水腫，對(duì)大鼠肉芽腫炎癥后期肉芽組織的增生有較好的抑制作用，這表明山豆根中所含生物堿具有直接抗炎作用[3]。

本研究采用角叉菜膠致大鼠足跖腫脹試驗(yàn)觀察山豆根的抗炎作用時(shí)-效關(guān)系，并同時(shí)檢測(cè)其對(duì)炎癥因子水平的影響，探討山豆根水提物抗炎的作用及與苦參堿體內(nèi)血藥濃度變化的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼養(yǎng)條件SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(150～180) g，購(gòu)自浙江維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(浙)2018-0001，動(dòng)物合格證號(hào)：33000800002240，質(zhì)量檢測(cè)單位：北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境普通級(jí)，溫度(20～24) ℃，相對(duì)濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于上海市食品藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物房。

1.2 藥物、試劑及配制山豆根，購(gòu)自廣西宏锃藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：廣西靖西縣，批號(hào)：20190307。山豆根水提浸膏粉由上海中藥制藥技術(shù)有限公司提?。阂运幉?∶水=1 ∶6的比例加水浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮1 h，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾藥渣，收集濾液。藥渣同前煎煮再次收集濾液。濾液70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至略微粘稠狀，75 ℃真空干燥，得浸膏粉，每克浸膏粉相當(dāng)于6.657 g生藥，經(jīng)檢測(cè)其中苦參堿含量為2.17%，氧化苦參堿含量為2.69%。氫化可的松(中國(guó)食品藥品檢定研究院，規(guī)格：約50 mg/瓶，批號(hào)100152-201707)；角叉菜膠(生產(chǎn)商：Sigma-Aldrich，CAS：9000-07-1，批號(hào)：SLBL6067V)；TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA 試劑盒，購(gòu)自信裕生物科技有限公司(批號(hào)：TNF-α XY-E30635, IL-1β XY-E30419, IL-6 XY-E30646)；苦參堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-201709)；西咪替丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100158-201406)；甲酸和乙腈為色譜純，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 儀器自制足跖容積測(cè)量?jī)x；API 5000 LC/MS/MS 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(AB SCIEX)，酶標(biāo)分析儀(DNM9602，北京普朗技術(shù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1山豆根對(duì)大鼠足跖腫脹的抗炎作用 取雄性SD大鼠44只，分為4組，分別為空白對(duì)照組(Control)、氫化可的松組(Hydrocortisone)、山豆根水提浸膏粉高劑量組(RRST-H)和低劑量組(RRST-L)。氫化可的松組灌胃給予40 mg·kg-1氫化可的松，山豆根水提浸膏粉高、低劑量組分別灌胃給予生藥0.6 g·kg-1和生藥0.3 g·kg-1山豆根水提浸膏粉溶液，給藥體積為20 mL·kg-1，空白對(duì)照組給予同體積純水,每日給藥1次，連續(xù)3日。

末次給藥后1 h，大鼠右后足跖皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的角叉菜膠溶液0.1 mL致炎，測(cè)定致炎前和致炎后0.5、1、2與3 h時(shí)的大鼠右后足跖容積，并計(jì)算腫脹率，腫脹度與腫脹率計(jì)算公式如下：

腫脹度=致炎后足跖容積-致炎前足跖容積

腫脹率/%=腫脹值/致炎前足跖容積×100%。

末次測(cè)定足跖容積后，各組大鼠致炎側(cè)后足自踝關(guān)節(jié)上5 mm處截取足爪組織制備勻漿液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)致炎組織中的炎癥因子：TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.4.2山豆根藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 取雄性SD大鼠10只，分為2組，分別為山豆根水提浸膏粉高劑量組和低劑量組。給藥劑量、給藥周期同抗炎作用試驗(yàn)，于末次給藥前和給藥后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8和24 h，經(jīng)眼眶后靜脈叢取血約0.5 mL，EDTA-2K抗凝管4 ℃離心(3 000 r·min-1，15 min)，分取血漿,采用LC/MS/MS檢測(cè)山豆根抗炎作用伴隨藥代動(dòng)力學(xué)研究藥代參數(shù)AUC(0-t)、Cmax、Tmax、T1/2。

色譜分析條件 Waters XBridge Amide色譜柱(4.6×100 mm，3.5 μm)，0.1%甲酸溶液- 乙腈=60：40(V/V)為流動(dòng)相；柱溫40 ℃；流速0.5 mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)置為10 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜分析條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子方式監(jiān)測(cè)。離子源噴霧電壓(IS)：5 500 V；溫度：450 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力：45 psi；氣體2(GS2，N2)壓力： 45 psi；氣簾氣體(N2)壓力：30 psi；碰撞氣(CAD，N2)壓力：4；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 249.3→m/z 148.2(苦參堿)、m/z 265.1→m/z 247.1氧化苦參堿和m/z 253.1→m/z 159.1(內(nèi)標(biāo))，去簇電壓(DP)為140 V，射入電壓(EP)為10 V，碰撞能量(CE)分別為46 eV(苦參堿)、40 eV(氧化苦參堿)和20 eV(內(nèi)標(biāo))，碰撞室射出電壓(CXP)為20 V。

血漿樣品的處理 取血漿100 μL，加入西咪替丁內(nèi)標(biāo)溶液(1 mg·L-1)10 μL，加入乙腈300 μL，渦旋3 min，20 000 r·min-1離心10 min。取上清200 μL進(jìn)樣。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物體質(zhì)量及一般癥狀試驗(yàn)期間各組動(dòng)物活動(dòng)均正常，未見(jiàn)異常體征及動(dòng)物死亡。動(dòng)物初始體質(zhì)量、終末體質(zhì)量組間均未見(jiàn)顯著性差異，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Effect of RRST on weight of

2.2 抗炎作用致炎之前，各組大鼠足跖基礎(chǔ)容積組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。致炎后，與空白對(duì)照組相比，氫化可的松組大鼠在0.5、1、2和3 h時(shí)的足跖腫脹率明顯降低(P<0.01)；山豆根水提浸膏粉高劑量組和低劑量組大鼠在0.5、1、2和3 h時(shí)的足跖腫脹率亦明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Effect of RRST on paw edema induced by carrageenan in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)山豆根水提浸膏粉高低劑量組大鼠體內(nèi)苦參堿含量呈劑量依賴性，高劑量組大鼠體內(nèi)苦參堿AUC值約為低劑量組大鼠體內(nèi)AUC值的兩倍，Tmax為1 h左右，半衰期為2 h左右，24 h體內(nèi)苦參堿消失殆盡，見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Anti-inflammatory effect of RRST based on pharmacokinetic

2.4 山豆根對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的角叉菜膠致大鼠足跖腫脹組織TNF-α、IL-6及IL-1水平的影響與空白對(duì)照組比較，氫化可的松組、山豆根水提浸膏粉高、低劑量組大鼠足跖腫脹組織的TNF-α及IL-1β水平均明顯降低(P<0.01)；氫化可的松組和山豆根水提浸膏粉高劑量組大鼠足跖腫脹組織IL-6水平顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)Tab 4。

Tab 4 Effect of RRST on content of TNF-α, IL-1β and IL-6 in inflammatory tissues induced by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

山豆根為使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材，因其豐富的藥用功能備受關(guān)注。山豆根臨床常用于預(yù)防及治療咽喉炎、扁桃體炎等疾病[4]，亦可以用于治療慢性乙型肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎及肝癌的輔助性治療[5]。山豆根治療咽喉疾病及發(fā)揮保肝藥效均與其調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)有關(guān)[6]。在抗炎作用研究方面，已有文獻(xiàn)報(bào)道山豆根對(duì)多種炎癥模型均顯示明顯的抑制作用，如山豆根對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹模型能明顯降低耳腫脹度，對(duì)巴豆油所致小鼠耳腫脹和瓊脂所致小鼠肉芽腫亦有較強(qiáng)的抑制作用[7]，對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性以及組織胺所致的大鼠皮膚毛細(xì)血管通透性模型均有明顯的抑制作用[8]。但山豆根對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型的抗炎藥效未見(jiàn)報(bào)道。

山豆根的化學(xué)成分主要有生物堿、多糖、黃酮類化合物[9-10]，其中生物堿是山豆根的主要活性成分[2]，包括苦參堿、氧化苦參堿及槐果堿。有文獻(xiàn)已報(bào)道山豆根化學(xué)成分苦參堿、氧化苦參堿在大鼠、犬、食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征[11-13]，但上述藥代動(dòng)力學(xué)研究均是以苦參堿和/或氧化苦參堿單體成分進(jìn)行的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，未見(jiàn)山豆根提取物混合組分進(jìn)行的藥代動(dòng)力學(xué)特征研究。另外，本研究結(jié)合山豆根抗炎藥效同步進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，基于血漿苦參堿和氧化苦參堿血藥濃度的變化考察山豆根抗炎藥效時(shí)-效關(guān)系，同時(shí)，考察山豆根發(fā)揮抗炎藥效作用時(shí)炎癥因子的表達(dá)，形成“抗炎藥效-血藥濃度-炎癥機(jī)制”三維整合研究的新思路，揭示山豆根發(fā)揮抗炎藥效的時(shí)效關(guān)系作用機(jī)制。

本研究采用角叉菜膠致大鼠足趾腫脹考察山豆根的抗炎作用。2015版《中國(guó)藥典》一部中，山豆根臨床用量為3～6 g[1]，按成人平均體重60 kg計(jì)算，人臨床用藥量為0.05～0.1 g·kg-1，大鼠等效劑量為0.3～0.6 g·kg-1。本研究動(dòng)物試驗(yàn)藥效劑量設(shè)計(jì)以《中國(guó)藥典》人臨床日用劑量上下線的等效劑量作為大鼠藥效高、低兩個(gè)劑量，通過(guò)測(cè)定大鼠足跖腫脹率，結(jié)果顯示上述等效劑量范圍內(nèi)的山豆根水提浸膏粉均可明顯抑制角叉菜膠致大鼠足跖的腫脹度。

在山豆根抗炎作用時(shí)-效關(guān)系研究中，氫化可的松組在角叉菜膠致炎后0.5、1、2與3 h時(shí)大鼠腫脹率非常顯著降低，山豆根水提浸膏粉高、低劑量組亦在致炎后0.5、1、2與3 h時(shí)大鼠腫脹率顯著降低，顯示山豆根水提浸膏粉高、低劑量組均具有較強(qiáng)的抗炎作用，且高劑量抗炎作用強(qiáng)于低劑量。在抗炎藥效同步進(jìn)行的藥代動(dòng)力學(xué)研究中，本研究檢測(cè)了血漿苦參堿和氧化苦參堿的血藥濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿體內(nèi)血藥濃度較低，接近生物分析定量限，結(jié)合本研究檢測(cè)山豆根藥材中苦參堿含量為2.17%，氧化苦參堿含量為2.69%，兩個(gè)成分含量均較低，吸收入血后，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道氧化苦參堿可在腸道菌的作用下代謝為更易吸收的苦參堿，苦參堿有著較高的生物利用度，較易吸收入血[13,14]，體內(nèi)氧化苦參堿的含量會(huì)進(jìn)一步降低，其檢測(cè)結(jié)果接近生物分析定量限，存在定量不準(zhǔn)確的因素，因此本研究藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)以苦參堿計(jì)。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示山豆根水提浸膏粉高劑量組大鼠體內(nèi)苦參堿AUC值約為低劑量組的兩倍，且高劑量組對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹率的抑制作用明顯強(qiáng)于低劑量組；大鼠體內(nèi)苦參堿Tmax為1 h左右，山豆根水提浸膏粉組大鼠足跖腫脹率也于1 h左右達(dá)到高峰后開(kāi)始下降，說(shuō)明山豆根水提浸膏粉對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹率的影響與大鼠體內(nèi)苦參堿血藥濃度具有高度相關(guān)性，提示苦參堿可以作為山豆根水提浸膏粉抗炎作用的標(biāo)志性物質(zhì)。

在抗炎作用炎癥因子的檢測(cè)中，本研究對(duì)末次測(cè)定足趾容積后腫脹組織TNF-α、IL-1β和IL-6含量進(jìn)行了測(cè)定。細(xì)胞因子是由多種組織細(xì)胞所合成和分泌的具有生物活性的小分子多肽或糖蛋白，主要包括腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素等[15]。TNF-α不僅具有很強(qiáng)的致炎活性，還可以刺激受損傷的組織細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素等炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)并放大損傷的炎癥反應(yīng)[16]。早期炎癥的致炎因子IL-1β可以與TNF-α 共同激活諸多免疫和炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展，進(jìn)而調(diào)控和誘導(dǎo)其他炎癥因子的分泌與釋放。IL-6具有多種功能, 如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng), 參與急性相反應(yīng)及炎癥反應(yīng)過(guò)程，易被一系列炎癥刺激及炎癥介質(zhì)所誘導(dǎo), 如TNF-α和IL-1 等，也是參與先天免疫(非條件免疫)的一種重要炎癥介質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)角叉菜膠誘發(fā)炎癥反應(yīng)后，山豆根水提浸膏粉可顯著下調(diào)致炎大鼠足跖腫脹組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，從而減輕炎癥反應(yīng)的程度，且高劑量組炎癥因子的含量低于低劑量組，提示劑量越高，抑制炎癥因子的表達(dá)作用越好，抗炎作用越強(qiáng)，結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，劑量越高，體內(nèi)苦參堿系統(tǒng)暴露量越大，抗炎作用越強(qiáng)。本研究從“抗炎藥效-血藥濃度-炎癥機(jī)制”三個(gè)方面整合，綜合評(píng)價(jià)山豆根抗炎藥效時(shí)效關(guān)系的作用機(jī)制，進(jìn)一步明確了山豆根的抗炎作用。

本研究基于藥代動(dòng)力學(xué)的藥效研究確定發(fā)揮療效的最低劑量，同理，基于毒代動(dòng)力學(xué)的毒理研究確定不產(chǎn)生毒性的最高劑量，由此為制定“有毒”中藥的安全劑量范圍，為藥典制定“有毒”中藥可測(cè)定成分含量及推薦安全劑量提供參考，為修訂和提升“有毒”中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。