吉非替尼耐藥肺癌細胞株建立及其EGFR信號通路改變

丁 萌，廖海秀，周楠楠，程 娟，王 琴，管世鶴，周 強，胡 偉，陳禮文

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥 230601)

肺癌是十大惡性腫瘤之一，嚴重危害人類生命健康，是全球癌癥相關死亡的最主要原因之一。在2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居首位，分別占總病例的11.6%和癌癥死亡總數(shù)的18.4%[1]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的組織學分類定義了兩種類型的肺癌：非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)。NSCLC約占所有肺癌的80%～85%[2]，腺癌(adenocarcinoma，ADC，約40%～50%)和鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC，約20%～30%)是NSCLC的主要組織學亞型[3]。雖然NSCLC在診治方面取得了很大的進展，但由于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)，NSCLC的總體生存率仍不理想[4]。

近15年來，隨著分子印跡技術、靶向治療藥物和精準藥物的發(fā)展，NSCLC的治療發(fā)生了巨大的變化[5]。NSCLC中常見的突變多見于肺腺癌，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、EML4-ALK、c-met等受體酪氨酸激酶是已知的驅(qū)動突變，這些突變通過激活下游信號通路促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。例如MEK/ERK/MAPK，PI3K/AKT/mTOR和JAK1/STAT3/5信號通路[6]。在NSCLC中，體細胞EGFR突變已被證明是生物標志物和有吸引力的藥物靶點的強有力的預測因子[7]。靶向突變EGFR治療已成功應用于NSCLC患者的臨床治療，如EGFR小分子抑制劑Gefitinib、Erlotinib等，臨床證明能有效延長患者的生存期，但隨著治療時間的延長，大多數(shù)患者會產(chǎn)生耐藥性[8]。本研究主要建立對Gefitinib耐藥的肺癌細胞株，探討其Gefitinib耐藥的之后EGFR下游信號通路的改變，以及不同細胞株之間的差異。

1 材料與方法

1.1 材料NSCLC細胞系HCC827和H3255購自上海富衡細胞庫；RPMI 1640培養(yǎng)基(C11875500BT)購自美國Gibco公司；胎牛血清購于南美Lonsera 公司(S711-001S)；吉非替尼(Gefitinib)購自美國Med Chem Express(MCE)公司(HY-50895)；CCK-8購于中國貝博生物公司(BB4221-1)；兔抗人單克隆抗體β-actin(AF7018)、Akt(AF6261)、p-Akt(Ser473,AF0016)、p-STAT3(Tyr705,AF3293)均購于美國Affinity公司；兔抗人單克隆抗體p-ERK1/2(ab214362)、STAT3(ab76315)、CD276(ab227670)，鼠抗人單克隆抗體ERK1/2(ab54230)均購于英國Abcam公司；羊抗兔(ZB-2301)和羊抗鼠(ZB-2305)二抗均購于中國中杉金橋公司；磷酸化抑制劑Cocktail l購自美國Med Chem Express(MCE)公司(HY-K0021)；蛋白裂解液RIPA購于中國碧云天公司(P0013B)；蛋白酶抑制劑PMSF購于美國Sigma公司(10837091001)。

1.2 方法

1.2.1人NSCLC細胞H3255和HCC827的培養(yǎng)及構建Gefitinib耐藥細胞株H3255/GR和HCC827/GR 人NSCLC細胞H3255、H3255/GR、HCC827和HCC827/GR用含胎牛血清(10%)、青霉素(100 KU·L-1)及鏈霉素(100 mg·L-1)的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱(HF90/HF240,Heal Force)中常規(guī)培養(yǎng)傳代。在人NSCLC Gefitinib敏感細胞株H3255的培養(yǎng)基中,按0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.075、 0.10 μmol·L-1濃度梯度逐步增加Gefitinib濃度,使用濃度為0.1 μmol·L-1的Gefitinib維持細胞耐藥性,以構建Gefitinib誘導耐藥株H3255/GR，在人NSCLC Gefitinib敏感細胞株HCC827的培養(yǎng)基中,按0.001、0.002、0.005、0.01、0.012 5、0.015、0.017 5、0.02 μmol·L-1濃度梯度逐步增加Gefitinib濃度,使用濃度為0.02 μmol·L-1的Gefitinib維持細胞耐藥性,以構建Gefitinib誘導耐藥株HCC827/GR。

1.2.2CCK8法檢測Gefitinib對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)(RI) 取對數(shù)生長期的細胞以1×106L-1的密度接種于96孔板,每孔100 μL,每組設3個復孔。Gefitinib以0.02、 0.05、 0.075、 0.10、 0.15、0.20、0.25、0.30 μmol·L-1(H3255細胞)或0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 5、0.025 μmol·L-1(HCC827細胞)濃度作用細胞,細胞培養(yǎng)72 h后,每孔加入含有10% CCK-8試劑的完全培養(yǎng)基100 μL，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱避光孵育2 h后，用酶標儀(BioTek Inc.，VT，USA)在波長450 nm處檢測各孔吸光度值(OD)，根據(jù)OD值計算細胞存活率(vital rate，VR)：VR=(用藥組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。根據(jù)藥物VR，由藥物濃度的對數(shù)值與VR線性回歸求出藥物的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，并計算其耐藥指數(shù)RI(resistance index)：RI=IC50(耐藥細胞)/IC50(誘導前細胞)。最后取3個平行孔的平均值。

1.2.3Western blot檢測細胞系中p-Stat3、p-ERK1/2和p-Akt的表達水平 取2×106個對數(shù)生長期的H3255、H3255/GR、HCC827和HCC827/GR細胞種于6孔板中,待長到80%～90%加入Gefitinib(H3255和H3255/GR為0.05 μmol·L-1，HCC827和HCC827/GR為0.012 5 μmol·L-1)處理24 h后，預冷PBS洗兩遍，每孔加入100 μL預冷的RIPA裂解液(含1% PMSF和1% Cocktail l)冰上裂解30 min,4 ℃、13 000×g離心30 min后取蛋白上清,用BCA蛋白定量試劑盒按照說明書嚴格操作,測定各組細胞株蛋白樣品濃度。將蛋白樣品20 μg經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到NC膜上,經(jīng)5%脫脂牛奶(TBST稀釋)室溫封閉1 h后,分別加入β-actin(1 ∶10 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(Ser473 1 ∶1 000)、p-STAT3(Tyr705 1 ∶1 000)、p-ERK1/2(1 ∶1 000)、ERK1/2(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶20 000)，4 ℃ 緩慢勻速振蕩過夜, TBST洗滌3次后,分別加入羊抗鼠二抗(1 ∶10 000)、羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫避光孵育1h, TBST洗滌3次后, ECL顯色(JS-1070P EV,Peiqing, Shanghai, China)。

2 結(jié)果

2.1 耐Gefitinib的肺腺癌細胞株的建立：H3255/GR和HCC827/GRH3255細胞和HCC827細胞連續(xù)6個月暴露在gefitinib濃度不斷增加的環(huán)境中，直到H3255細胞能夠在0.1 μmol·L-1Gefitinib中增殖，HCC827細胞能在0.02 μmol·L-1Gefitinib中增殖。采用CCK-8法檢測了HCC827/GR和H3255/GR細胞對Gefitinib的抗性。結(jié)果顯示，Gefitinib明顯降低了HCC827細胞和H3255細胞的存活率，而相對較高的Gefitinib濃度抑制了HCC827/GR細胞和H3255/GR細胞的存活率。CCK-8結(jié)果顯示，0.048±0.002 μmol·L-1，H3255/GR的IC50為0.448±0.171 μmol·L-1(RI=9.566±3.679)，HCC827的IC50為0.013±0.003 μmol·L-1，HCC827/GR的IC50為0.18±0.016 μmol·L-1(RI=13.822 2±1.041)。在H3255/GR和HCC827/GR中，Gefitinib的半抑制濃度(IC50)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 H3255/GR和HCC827/GR細胞的增殖較H3255和HCC827降低在此，我們進一步研究表明，與非耐藥株相比，Gefitinib耐藥導致H3255和HCC827細胞的增殖顯著減少。在培養(yǎng)24、48和72 h 后，H3255/GR和HCC827/GR株的細胞增殖較敏感株明顯減少。

2.3 H3255/GR和HCC827/GR細胞株信號通路的改變我們檢測了Gefitinib處理的H3255和H3255/GR，HCC827 和HCC827/GR細胞中ERK1/2、AKT和STAT3的總水平和磷酸化水平。結(jié)果顯示H3255/GR和HCC827/GR的p-AKT、p-ERK1/2和p-Stat3與非耐藥株相比未觀察到明顯變化。在H3255細胞中，Gefitinib對p-AKT和p-STAT3有明顯的抑制作用，對p-STAT3、p-ERK1/2也有中度抑制作用，而對p-ERK1/2僅有輕度抑制作用。而在H3255/GR細胞中p-ERK1/2和p-Stat3表達水平亦無明顯改變，但p-AKT表達明顯下調(diào)。結(jié)果顯示，Gefitinib處理的HCC827細胞的p-ERK1/2，p-AKT和p-STAT3的表達明顯降低，p-STAT3和p-ERK1/2的表達也有一定程度的降低，其中p-AKT和p-STAT3幾乎失去表達。在HCC827/GR細胞中，我們發(fā)現(xiàn)Gefitinib處理后其p-AKT和p-STAT3表達幾乎不被抑制，p-ERK1/2被中度抑制，Gefitinib幾乎失去了對其信號的抑制作用。

Fig 1 Survival rate and IC50 of H3255, H3255/GR, HCC827 and HCC827/GR cells at different gefitinib concentrationsA. The survival rates of H3255 and H3255/GR cell lines were treated with 0～0.3 μ mol·L-1 Gefitinib for 72 hours. B. The survival rates of HCC827 and HCC827/GR cell lines were treated with 0～0.125 μ mol·L-1 Gefitinib for 72 hours. C. Calculation of semi-inhibitory concentration(IC50) of H3255 and H3255/GR cells by SPSS22. D. The semi-inhibitory concentrations(IC50) of HCC827 and HCC827/GR cells were calculated by SPSS22,*P<0.05,**P<0.01

Fig 2 Proliferation of H3255, H3255/GR,HCC827 and HCC827/GR n=3)A. The proliferation of H3255 and H3255/GR cells was observed at 0 h, 24 h, 48 h and 72 h. B. The proliferation of HCC827 and HCC827/GR cells was observed at 0 h, 24 h, 48 h and 72 h,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

大多數(shù)攜帶EGFR突變激活基因的NSCLC病例，如外顯子19缺失(Del E746-A750)和外顯子21突變(L858R)，最初對EGFR TKI敏感。吉非替尼通過抑制腫瘤細胞內(nèi)的多個信號通路的激活, 降低MAPK或者AKT的激活程度, 從而抑制上游轉(zhuǎn)錄基因的啟動。有研究證實，吉非替尼能夠在抑制癌細胞快速跨越G0期方面發(fā)揮作用, 從而降低癌細胞的侵襲，轉(zhuǎn)移和浸潤能力[10]。然而，他們中的絕大多數(shù)最終獲得了對藥物的耐藥性[11]。目前, 非小細胞肺癌患者Gefitinib耐藥的機制主要分為EGFR發(fā)生二次突變(最常見的為T790M突變)[12]，STAT3信號通路的異常激活[13]和PI3K/Akt信號通路的持續(xù)活化等[14]。

在本研究中，我們利用逐步增加Gefitinib濃度法成功建立了Gefitinib耐藥株H3255/GR和HCC827/GR株。對親本細胞H3255、HCC827和耐藥細胞H3255/GR、HCC827/GR對Gefitinib敏感性進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥細胞的IC50明顯高于親本細胞，Gefitinib處理的在H3255/GR細胞中p-ERK1/2和p-Stat3表達水平亦無顯著改變，但p-AKT表達顯著下調(diào)，在HCC827/GR細胞中，我們發(fā)現(xiàn)Gefitinib處理后其p-AKT和p-STAT3表達幾乎不被抑制，p-ERK1/2被中度抑制。H3255/GR和HCC827/GR細胞Gefitinib耐藥的信號機制存在明顯差異。而H3255經(jīng)Gefitinib處理后p-ERK1/2的水平僅輕度下調(diào)，這表明在H3255細胞中，RAS/RAF/MEK/ERK1/2通路在EGFR下游信號通路中沒有發(fā)揮功能優(yōu)勢，先前的研究也表明，L858R突變降低了激活ERK1/2的能力，這是由于EGFR的內(nèi)吞作用受損和Src同源區(qū)2域含磷酸化酶-2(SHP-2)的Y542磷酸化減少所致[15]。另一方面，這些發(fā)現(xiàn)有力地說明了EGFR突變亞型Del E746-A750和L858R在EGFR下游信號通路的旁路激活上的差異。在耐吉非替尼的情況下，H3255/GR和HCC827/GR細胞中的JAK2/STAT3通路和HCC827/GR細胞中的PI3K/AKT通路均可被完全旁路激活。這些發(fā)現(xiàn)進一步證實了旁路激活信號的靶向抑制可能是治療EGFR-TKI耐藥的一個有前途的選擇?？紤]到信號網(wǎng)絡具有復雜的調(diào)控機制，未來的研究更需要針對旁路激活，并將受益于基于EGFR突變亞型的分層。

綜上所述，吉非替尼耐藥導致H3255和HCC827細胞的增殖減少。此外，證明了在H3255/GR和HCC827/GR細胞系中JAK2/STAT3級聯(lián)的旁路激活，以及在HCC827/GR株中PI3K/AKT通路的旁路激活。相比之下，H3255/GR細胞中的PI3K/AKT和HCC827/GR細胞中的Raf/MEK/ERK 1/2通路仍可被EGFR信號激活。

Fig 3 Expression of EGFR downstream signal protein in H3255, H3255/GR, HCC827 and HCC827/GR A～C. Detection of p-ERK1/2, p-AKT and p-STAT3 expression in H3255 and H3255/GR cells were treated with or without Gefitinib(0.05 μmol·L-1) by Western blot. D～F. The expression of p-ERK1/2, p-AKT and p-STAT3 in HCC827 and HCC827/GR cells with or without Gefitinib (0.012 5 μmol·L-1).G～H. The gray value of signal protein was analyzed for the difference between groups,*P<0.05,**P<0.01 vs H3255 or HCC827;##P<0.01 vs H3255/GR or HCC827/GR