阿爾茨海默病患者外周血microRNA-146a、Aβ1-42蛋白、tau蛋白的表達及臨床意義①

黃 攀 徐 敏 何曉英 易興陽

(德陽市人民醫(yī)院，德陽 618000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種發(fā)生在老年期或者老年前期的慢性中樞神經(jīng)退行性疾病，主要以進行性認知功能障礙、記憶力下降、日常生活能力下降、精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)[1]。據(jù)估算，我國現(xiàn)有AD患者600萬～800萬，面對如此龐大的患病群體，AD治療的選擇方案極少，究其原因是由于AD的發(fā)病機制尚不完全明確[2,3]，而隨著家族性AD的發(fā)現(xiàn)，基因?qū)W說參與AD的致病逐漸受到人們的關(guān)注。microRNA是一類長17～23個核苷酸長度的非編碼小分子物質(zhì)，廣泛參與機體生長、發(fā)育以及疾病發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)microRNA-146a在術(shù)后認知功能障礙、孤獨癥等疾病中存在著差異表達譜，并且與這些疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-6]。為了解microRNA-146a在AD患者中是否也存在著差異表達以及在AD的發(fā)病中發(fā)揮著何種機制，特設(shè)計此研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取我院2015年7月至2018年7月住院治療的AD患者98例作為試驗組(experiment group,exp group)，其中男性54例，女性44例，年齡66～81歲，平均(67.18±6.53)歲。另選取健康者50例作為對照組(control group)，其中男性26例，女性24例，年齡65～80歲，平均(68.74±6.62)歲。試驗組納入標準：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》[7]中有關(guān)于阿爾茨海默病的疾病診斷標準的患者；②年齡>60歲的患者；③簡易智能精神狀態(tài)量表(mini-mentai state examination，MMSE)評分提示存在認知功能障礙的患者，即文盲患者MMSE≤17分，小學(xué)患者≤20分，中學(xué)及以上文化程度患者≤24分；④能完成本研究的患者；⑤頭顱CT或MRI、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查提示無腦出血、腦梗死、顱內(nèi)占位的患者。試驗組排除標準：①其他類型癡呆患者如血管性癡呆、晚期帕金森病患者、顱內(nèi)感染患者、精神分裂癥、抑郁癥患者；②伴有嚴重的心、肝、肺、腎功能不全患者；③明顯衰竭患者；④已使用過治療癡呆藥物；⑤MMSE評分大于24分的AD患者。對照組納入標準：無中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、無癡呆的非神經(jīng)系統(tǒng)疾病者、無嚴重心肝腎肺疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者或法定授權(quán)人簽署知情同意書。兩組在年齡、性別等一般資料方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.1.2儀器 離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，TGL-16c)，Trizol試劑盒(InvitroggenTM，15596-026)，核酸蛋白測定儀(上海琪特，WXJ-9388),PCR擴增儀(杭州博日科技，TC-XP)。

1.2方法

1.2.1樣本采集 清晨抽取所有納入者空腹外周靜脈血樣本5 ml，放置于室溫下自然凝固15 min，然后將凝固的血液樣本在3 000 r/min的離心機中離心30 min，離心后仔細分離收集上層血清并儲存在-80℃超低溫冰箱，用于血清總RNA 的提取及RT-PCR、ELISA、Aβ1-42蛋白、tau蛋白的檢測。

1.2.2RT-PCR檢測 按照Trizol試劑盒提取血清總RNA后以核酸蛋白測定儀測定的OD260/OD280的值在1.8～2.0視為合格RNA，然后采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA(InvitrogenTM,C-28025)，第一鏈cDNA合成后將RT-PCR反應(yīng)混合液置于PCR擴增儀的96孔反應(yīng)板中，2×PCR Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L)1.0 μl，Template 1.0 μl，ddH2O 2.8 μl，Rox0.2 μl，總體積10 μl，每個樣本均做3復(fù)孔，擴增循環(huán)條件:95℃，1 min;95℃、15 s，58℃、20 s，72℃、45 s，共 40 個循環(huán)。microRNA-146a引物序列為:Forward:5′-CCTGAGAAGTGAATTCCATGGG-3′；reverse:5′-CTCAACTGGTGTCGTGG-AGTC-3′；內(nèi)參基因U6引物序列為：Forward:5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′；reverse:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。因RT-PCR中Ct值不能作為原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，本研究采用2-ΔΔCt代表microRNA的相對表達量。ΔCt=(目標microRNA Ct值-內(nèi)參基因U6 Ct值)。

1.2.3Aβ1-42蛋白、tau蛋白濃度檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定兩組患者外周血清中Aβ1-42蛋白、tau蛋白濃度，試劑盒由武漢拜意爾生物科技有限公司提供，酶標儀由北京普朗新技術(shù)有限公司，型號DNM-9602。嚴格按照說明書步驟建立標準曲線后根據(jù)各孔的吸光度計算Aβ1-42蛋白、tau蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1兩組基線資料比較 兩組患者基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示二者具有可比性(P>0.05)。見表1。

2.2microRNA-146a在人類基因組中位置及保守性分析 采用加州大學(xué)圣克魯斯分校研制的UCSC基因組在線工具(http://genome-asia.ucsc.edu)對microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性分析發(fā)現(xiàn)，microRNA-146a定位于5q33.3人染色體上160485325-160485450位置，長度為99 bp，并且其核苷酸序列在人、恒河猴、小鼠、狗、大象、雞6個物種中高度保守。見圖1。

2.3兩組患者外周血清microRNA-146a、Aβ1-42、tau蛋白比較 試驗組患者外周血清中microRNA-146a的相對表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而試驗組患者外周血清中Aβ1-42濃度明顯低于對照組，tau濃度高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 microRNA-146a在人類基因組中的位置及保守性分析Fig.1 Location and conservation of microRNA-146a in human genome

表1 兩組患者基線資料比較

Tab.1 Comparison of baseline data between two groups

ItemExp group(n=98)Control group(n=50)t/χ2PSex(Male/Female)54/4426/240.120.72Age(year)67.18±6.5368.74±6.621.360.17BMI(kg/m2)22.87±3.2323.65±3.411.340.18Hypertension[n(%)]33(33.67%)14(28.00%)0.490.48 Diabetes[n(%)]18(18.36%)6(12.00%)0.980.32TG(mmol/L)1.42±0.211.46±0.220.590.55TC(mmol/L)4.17±0.854.10±0.920.520.60HDL-C(mmol/L)0.93±0.350.84±0.321.550.12LDL-C(mmol/L)2.71±0.852.92±0.911.490.14

表2 兩組患者外周血清microRNA-146a、Aβ1-42、tau蛋白比較

Tab.2 Comparison of microRNA-146a,Aβ1-42,tau protein between two groups

ItemExp groupControl grouptPmicroRNA-146a2.45±0.430.98±0.1231.520.00Aβ1-42(pg/ml)37.43±6.7551.26±9.249.380.00tau(pg/ml)22.87±4.5113.64±2.9115.030.00

2.4microRNA-146a與Aβ1-42、tau蛋白相關(guān)性分析 試驗組患者外周血microRNA-146a與Aβ1-42蛋白呈負相關(guān)性(r=-0.882，P=0.000)，與tau蛋白無相關(guān)性(r=0.129，P=0.205)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 microNRA-146a與Aβ1-42、tau蛋白相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between microNRA-146a and Aβ1-42,tau protein

3 討論

AD的組織病理學(xué)改變?yōu)樯窠?jīng)炎性斑(嗜銀神經(jīng)軸索突起包繞Aβ而形成)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(由過度磷酸化的微管tau蛋白于神經(jīng)元內(nèi)高度螺旋化形成)以及神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)增生[8]。在機體中β水解酶和γ水解酶通過水解淀粉樣前體蛋白形成Aβ1-40和Aβ1-42蛋白，研究顯示單體的Aβ蛋白并無神經(jīng)毒性，而當(dāng)單體水解后產(chǎn)生可溶性Aβ聚集體才是導(dǎo)致AD發(fā)病的關(guān)鍵因素[9]。Aβ寡聚體可與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多種受體識別結(jié)合，引起神經(jīng)元細胞鈣超載、小膠質(zhì)細胞膜電位下降、谷氨酸水平升高進而導(dǎo)致AD的發(fā)生[10]。雖然機體內(nèi)Aβ1-42的表達量遠不及Aβ1-40，但Aβ1-42的神經(jīng)毒性卻遠強于Aβ1-40且更容易形成淀粉樣蛋白從而導(dǎo)致神經(jīng)炎性斑的形成[11]。tau蛋白分布于神經(jīng)元內(nèi)，與微管蛋白結(jié)合后形成微管，這種復(fù)合物對于維持神經(jīng)細胞的軸突運輸以及細胞骨架的穩(wěn)定性具有重要作用[12]。tau蛋白分子結(jié)構(gòu)上具有很多磷酸化位點，病理狀態(tài)下tau蛋白被過度磷酸化，這種過度磷酸化的tau蛋白不再具有結(jié)合微觀蛋白的能力，反而具有促進tau蛋白相互聚合纏繞形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)[13]，tau蛋白的聚合被認為是AD形成的基礎(chǔ)[14,15]。既往對于Aβ1-42蛋白及tau蛋白的研究主要集中于腦脊液中，然而腦脊液獲取標本較難，外周血取材方便，積極探索外周血中Aβ1-42蛋白及tau蛋白對于AD的診斷具有重要意義，然而由于血腦屏障的存在且外周血容量較大，相關(guān)蛋白濃度被大大稀釋，因此必須采用靈敏度高的檢測手段。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)相對于其他檢測方法靈敏度大大提高，其原理為酶是一種有機催化劑，極少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象，因此該體系常被稱為酶放大體系，其精確程度達到可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，甚至在微克、甚至納克水平上對其進行定量[16]。在本研究中運用ELISA技術(shù)對試驗組與對照組患者外周血清中的Aβ1-42蛋白濃度及tau蛋白濃度進行定量檢測，結(jié)果顯示AD患者外周血清中Aβ1-42蛋白濃度明顯低于對照組，提示AD患者外周血Aβ1-42蛋白水平可以作為AD潛在的生物學(xué)標志物。目前關(guān)于AD患者外周血Aβ1-42蛋白表達趨勢尚未統(tǒng)一，部分文獻與本文結(jié)果不一致，經(jīng)查閱相關(guān)文獻推測可能有以下幾種原因：①AD發(fā)生時，腦脊液中大量的Aβ1-42蛋白在腦內(nèi)纏繞形成神經(jīng)元炎性斑，進而導(dǎo)致分泌外周血中的Aβ1-42蛋白減少；②外周血中Aβ1-42蛋白還可由血小板及骨骼肌分泌，其代謝受到肝腎功能的影響；③Aβ1-42蛋白分子結(jié)構(gòu)決定其疏水活性，與外周血中的脂蛋白、清蛋白結(jié)合使得其檢測結(jié)果也會受到影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)AD患者tau蛋白濃度明顯高于對照組，與其他研究結(jié)論類似，目前認為腦脊液中tau蛋白濃度可以較好地識別AD患者穩(wěn)定期與進展期，而外周血tau蛋白則可以區(qū)分AD患者與認知功能正常者[17]。

microRNA是一類可調(diào)節(jié)蛋白表達轉(zhuǎn)錄的小分子RNA，廣泛參與疾病發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控，其在外周血中表達穩(wěn)定，可被穩(wěn)定的檢測，已成為多種疾病的生物學(xué)標志物[18]。microRNA功能多樣，同一種microRNA在不同物種之間可能表達不同，也具有不同的功能[19]。microRNA-146a是眾多RNA分子家族成員中的一員，為進一步探究AD患者外周血清中microRNA-146a的表達譜，本研究先通過生物信息學(xué)方法顯示microRNA-146a在人體中具有高度保守性，這為設(shè)計microRNA-146a引物序列以及后續(xù)試驗奠定了基礎(chǔ)，而RT-PCR檢測結(jié)果也表明AD患者外周血清中microRNA-146a相對表達水平高于對照組，提示microRNA-146a可以與AD的發(fā)病有關(guān)。為進一步探討其在AD中的可能機制，本研究采用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)microRNA-146a與Aβ1-42蛋白存在負相關(guān)性，而與tau蛋白無相關(guān)性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥也是引起AD的原因之一[20]，其中重要的機制便是AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)分泌的炎癥因子可以降低降解Aβ蛋白的關(guān)鍵酶-胰島素降解酶，導(dǎo)致Aβ清除減少而沉積于腦內(nèi)形成炎性斑塊[21,22]，而研究發(fā)現(xiàn)microRNA-146a可以通過多種途徑參與炎癥反應(yīng)，起到抑制炎癥的作用，包括負性調(diào)節(jié)重要的炎癥信號通路TLR通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路[23-26]等，提示在AD患者中microRNA-146a的表達升高可能通過負性調(diào)控炎癥反應(yīng)進而參與Aβ1-42蛋白的清除。此外，研究也發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)不僅可以影響tau蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾，還進而以影響寡聚tau蛋白的傳播進而參與AD的發(fā)病[27,28]，但本研究并未發(fā)現(xiàn)microRNA-146a與tau蛋白的相關(guān)性，推測炎癥雖然參與AD的發(fā)病，但在AD患者microRNA-146a并未通過調(diào)控影響tau蛋白代謝的炎癥反應(yīng)，其具體機制還需進一步研究證實。

綜上所述，AD患者外周血清中存在microRNA-146a、Aβ1-42蛋白、tau蛋白的差異表達，且microRNA-146a在AD的發(fā)病中可能是通過調(diào)控Aβ1-42蛋白而不是tau蛋白，microRNA-146a可能是潛在治療AD的靶點。然而，本研究樣本量較小、單中心研究、僅進行了相關(guān)性分析，未對其機制進入研究，其結(jié)論尚需更多的研究補充驗證。