蝦青素對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的降脂、抗氧化和抗炎作用研究

張克連 郭靜宜 戴若竹

(福建省泉州市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，泉州 362000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是多種心腦血管疾病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)。由AS導(dǎo)致的心肌梗死、腦中風(fēng)等疾病已成為嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，近些年AS的發(fā)病率越來越高，且呈年輕化趨勢(shì)，因此控制AS的發(fā)生發(fā)展對(duì)預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病尤為重要。大量研究表明，膽固醇可能參與了AS的發(fā)生和發(fā)展，低密度脂蛋白及其氧化型能增加動(dòng)脈壁膽固醇內(nèi)流和沉積，促進(jìn)AS形成；相反，高密度脂蛋白和氧化型高密度脂蛋白則通過抑制固醇內(nèi)流和沉積，從而阻止AS的發(fā)生發(fā)展[1]。研究也表明，炎癥是AS的重要特征和啟動(dòng)因子，它導(dǎo)致血管中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，從而促進(jìn)脂質(zhì)沉積。在AS的發(fā)展中，IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)等炎癥因子發(fā)揮著重要作用[2,3]。

低密度脂蛋白的氧化假說給AS的抗氧化治療提供了理論依據(jù)。許多抗氧化性物質(zhì)用于阻滯動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展研究[4,5]。蝦青素(astaxanthin)是一種類胡蘿卜素，是最強(qiáng)的天然抗氧化劑之一，能有效清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，增強(qiáng)細(xì)胞再生能力，除此之外還能增強(qiáng)免疫力，預(yù)防心腦血管疾病[6]。本研究應(yīng)用ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立AS模型，采用蝦青素進(jìn)行干預(yù)，研究蝦青素在降低脂質(zhì)，對(duì)抗氧化、炎癥因子和血小板聚集等方面對(duì)AS產(chǎn)生的保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料 蝦青素(≥95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)；總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、總超氧化物歧化酶(total superoxide disumutase,T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠IL-6、小鼠MCP-1和小鼠超敏C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量(20±2)g(北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXR(京)2014-0004，合格證號(hào):11401300034676)。

Synergy2 多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰公司)，高速離心機(jī)(美國Sigma公司)，全自動(dòng)生化檢查儀，血糖監(jiān)測(cè)儀，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，凝聚計(jì)(美國Chrono-log公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠的飼養(yǎng) 取小鼠40只單獨(dú)喂養(yǎng)，隨機(jī)分為4組：正常組(10只)、高脂組(10只)，蝦青素低劑量組(10只)和蝦青素高劑量組(10只)。正常組自由攝入普通飼料和水，高脂組和蝦青素治療組均給予高脂飲食(含有75%普通飼料，10%豬油、0.3%膽酸和15%蛋黃粉)喂養(yǎng)。將蝦青素與0.5%蔗糖酯水溶液混合制成混懸液，每天經(jīng)口灌胃給藥0.2 ml，低和高劑量分別為50 mg/kg和150 mg/kg，模型組和正常組每天給予0.2 ml 0.25%蔗糖酯水溶液。于實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，定期對(duì)小鼠進(jìn)行稱重。每2日更換墊料，添加1次食物，喂養(yǎng)時(shí)間150 d。

1.2.2血脂和血糖指標(biāo)的測(cè)定 于喂養(yǎng)后50 d、100 d 和150 d，禁食12 h，穿刺眼球后靜脈叢取血0.4～0.5 ml，3 000 g離心10 min，取血清，采用全自動(dòng)生化檢查儀檢測(cè)TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，采用血糖監(jiān)測(cè)儀測(cè)定血糖水平。

1.2.3氧化指標(biāo)的測(cè)定 取1.2.2項(xiàng)下喂養(yǎng)150 d的各組小鼠的血清，分別采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)、ABTS法、比色法和硫代巴比妥酸法檢測(cè)T-SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA水平。

1.2.4炎癥因子的測(cè)定 取1.2.2項(xiàng)下喂養(yǎng)150 d的各組小鼠的血清，按照ELISA試劑盒的說明書操作，測(cè)定血漿中炎癥因子IL-6、CRP和MCP-1的水平。

1.2.5血小板聚集 取1.2.2項(xiàng)下喂養(yǎng)150 d的各組小鼠的全血0.5 ml，置于3.2%檸檬酸鹽緩沖液中，按照文獻(xiàn)[7]于37℃下(采用2-通道凝集計(jì))進(jìn)行光學(xué)血小板聚集試驗(yàn)，5 min左右會(huì)出現(xiàn)最大聚集，作為聚集度的測(cè)定值。

1.2.6主動(dòng)脈取材及斑塊分析 取喂養(yǎng)150 d的各組小鼠，2%戊巴比妥麻醉小鼠，快速取出自心臟始發(fā)1～2 mm處主動(dòng)脈。主動(dòng)脈用生理鹽水灌流，放置于多聚甲醛中固定，過夜后轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液脫水。取脫水后的主動(dòng)脈，縱向剖開，量取油紅O液染色1 h，用60%異丙醇浸泡標(biāo)本至斑塊底色為白色。蒸餾水清洗后將主動(dòng)脈于黑色硅膠墊上平鋪固定，鏡檢拍照，用Image J軟件記錄并分析測(cè)量斑塊面積，以斑塊面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比數(shù)作為斑塊大小的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

用OCT包埋整個(gè)主動(dòng)脈根本，并用液氮快速冷凍，進(jìn)行冷凍切片，切片厚度為7 μm，對(duì)每一根胸主動(dòng)脈至少進(jìn)行5個(gè)橫剖面的分析。用于油紅O染色的切片恢復(fù)室溫后使用蒸餾水潤洗,后置于100%丙二醇溶液脫水2 min，用油紅O工作液室溫下染色1 h，鏡檢拍照。

2 結(jié)果

2.1蝦青素對(duì)小鼠體重的影響 各組小鼠飲食正常，毛被正常，體重穩(wěn)定增加，未出現(xiàn)死亡情況和疾病異常。高脂組小鼠體重增幅最大，與正常組小鼠體重相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，蝦青素低劑量組和高劑量組體重增幅略低于高脂組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示蝦青素對(duì)小鼠無毒副作用，對(duì)小鼠體重的增長無顯著影響，見圖1。

2.2生化指標(biāo)分析

2.2.1蝦青素對(duì)血脂和血糖的影響 與正常組比，高脂組血清中TC、TG、LDL-C和血糖水平都顯著升高(P<0.05)，HDL-C顯著降低(P<0.05)。與高脂組比較，蝦青素組血清中TC、TG、LDL-C和血糖水平均顯著降低(P<0.05)，HDL-C顯著增高(P<0.05)，且呈劑量依賴性趨勢(shì)，見圖2。

2.2.2蝦青素對(duì)血清中的T-SOD、T-AOC、MDA和GSH-Px水平的影響 與正常組比，高脂組的T-SOD、T-AOC和GSH-Px明顯降低(P<0.01)，MDA明顯增高(P<0.01)，與高脂組比，蝦青素組的T-SOD、T-AOC和GSH-Px均有不同程度地升高(P<0.05)，MDA不同程度地降低(P<0.05)，呈劑量依賴性趨勢(shì)，見表1。

2.2.3蝦青素對(duì)血清中的炎癥因子MCP-1、CRP和IL-6的影響 與正常組比，高脂組MCP-1、CRP和IL-6水平均顯著增高(P<0.01)，與高脂組比，蝦青素組的MCP-1、CRP和IL-6水平均明顯降低(P<0.01)，呈劑量依賴性趨勢(shì)，見圖3。

2.3蝦青素對(duì)動(dòng)脈硬化斑塊的影響 正常組血管管壁較光滑，內(nèi)膜無明顯增厚，未見明顯斑塊形成，斑塊面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比為(13.14±0.61)%。高脂組小鼠主動(dòng)脈血管壁染色層明顯增厚，而且厚薄不均勻無規(guī)則，內(nèi)皮有部分脫落現(xiàn)象，這說明脂質(zhì)累積成為脂質(zhì)池，有大量的泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤血管，使管內(nèi)形成明顯的斑塊，斑塊面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比為(41.23±6.57)%，與正常組比明顯增高(P<0.01)。與高脂組比，蝦青素高(30.14±5.47)%和低劑量(28.71±4.2)%組斑塊面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖4。

2.4蝦青素對(duì)血小板聚集的抑制作用 高脂組、蝦青素高劑量組及蝦青素低劑量組的血小板聚集度分別為(40.6±1.6)%、(29.4±3.1)%和(15.4±4.2)%，與高脂組相比，蝦青素組血小板聚集度明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性趨勢(shì)。

圖1 蝦青素對(duì)小鼠體重增長的影響Fig.1 Effect of astaxanthin on body weight of mice

圖2 不同時(shí)間各組ApoE-/-小鼠的TC、TG、LDL-C、HDL-C和血糖水平Fig.2 Comparison of TC,TG,LDL-C,HDL-C and blood glucose of different groups of AopE-/- mice in different timeNote: Compared with the normal group,#.P<0.01;compared with the high fat group,△.P<0.05,*.P<0.01.

表1 各組ApoE-/-小鼠血清中的T-SOD、T-AOC、MDA和GSH-Px的水平

Tab.1 Comparison of T-SOD，T-AOC，MDA and GSH-Px level of different groups of ApoE-/-mice

GroupsT-SOD(U/ml)T-AOC(U/ml)MDA(nmol/ml)GSH-Px(U/ml)Normal135.26±3.653.18±0.6231.93±2.98210.25±4.13High fat90.31±9.611)1.42±0.871)56.54±5.251)155.38±2.491)Astaxanthin low dose132.35±5.573)2.29±0.972)30.12±4.573)248.27±4.513)Astaxanthin high dose144.12±3.693)3.61±0.293)28.09±6.123)310.21±5.793)

Note：Compared with the normal group,1)P<0.01；compared with the high fat group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖3 各組ApoE-/-小鼠的炎癥因子Fig.3 Comparison of inflammatory factors of different groupsNote: Compared with the normal group,#.P<0.01；compared with the high fat group,*.P<0.01.

圖4 不同組ApoE-/-鼠胸主動(dòng)脈病理圖Fig.4 Histomorhologic changes in aorta of different groups

3 討論

研究表明，動(dòng)物高脂喂養(yǎng)后，其血清中TC、TG和LDL-C等水平明顯升高，HDL-C水平降低。經(jīng)過長時(shí)間高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠在動(dòng)脈上能形成AS脂質(zhì)斑塊，為此建立了實(shí)驗(yàn)用的AS模型。人類長期食用高脂高糖膳食也會(huì)造成血脂異常和血管硬化[8]。本研究用蝦青素干預(yù)高脂喂養(yǎng)的小鼠，扭轉(zhuǎn)了TC、TG、LDL-C及血糖水平緩慢升高的趨勢(shì)，而且使其各指標(biāo)降低。高劑量組指標(biāo)降低更顯著，說明具有劑量依賴性。HDL-C將血管床中多余的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟后由膽汁排出體外。HDL-C的升高會(huì)有助于TC的降低。

LDL-C氧化修飾被認(rèn)為是AS形成的關(guān)鍵啟動(dòng)因素。氧化低密度脂蛋白(oxLDL-C)具有細(xì)胞毒性，能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的改變，例如內(nèi)皮細(xì)胞變性、壞死或者脫落，破壞內(nèi)皮細(xì)胞完整性。血液中的單核細(xì)胞及LDL通過損傷的血管內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)膜下，加速脂質(zhì)條紋的形成。oxLDL也是刺激內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥的因子。oxLDL能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞表明的清道夫受體數(shù)量并被過度攝取，導(dǎo)致胞內(nèi)大量膽固醇聚集進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞，大量泡沫細(xì)胞停留在血管壁內(nèi)，使AS斑塊形成[9]。通過觀察小鼠AS斑塊發(fā)現(xiàn)，確實(shí)存在碎片脫落和脂質(zhì)堆積結(jié)構(gòu)中間空隙較大現(xiàn)象，這可能與oxLDL能夠改變血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。

蝦青素是一種具有強(qiáng)大抗氧化特性的類胡蘿卜素，其抗氧化活性是維生素E的550倍,是β-胡蘿卜素、玉米黃素、葉黃素和角黃素等類胡蘿卜素的10倍，被譽(yù)為“超級(jí)抗氧化劑”。在提高免疫力、抗癌抗腫瘤、保護(hù)眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、延緩衰老等方面具有積極的促進(jìn)作用。機(jī)體的氧化應(yīng)激是指由于自由基過量生成和/或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多重毒性作用的病理狀態(tài)。人體很多疾病(比如心臟病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、癌癥和心腦血管疾病等)的發(fā)生和發(fā)展與自由基參與的氧化作用有關(guān)[10]。T-AOC是反映機(jī)體整體抗氧化水平的重要指標(biāo)。SOD為酶型抗氧化物質(zhì)，能清除超氧陰離子。MAD是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，MDA的測(cè)定常常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，是反映氧化應(yīng)激較好的指標(biāo)[9]。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到氧化自由基攻擊后，會(huì)引發(fā)脂質(zhì)的過氧化作用，從而促使MDA的產(chǎn)生。所以血清中MDA的含量可以反映機(jī)體的氧化情況[10]。研究檢測(cè)血清中T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px水平，高脂組小鼠的T-AOC、SOD和GSH-Px水平下降明顯，而MDA水平明顯提高。表明高脂飲食誘導(dǎo)了脂質(zhì)過氧化物，從而使機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制受損，而蝦青素的干預(yù)能明顯改善實(shí)驗(yàn)小鼠的抗氧化能力。

炎癥因子研究結(jié)果表明，蝦青素干預(yù)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠，能顯著降低血清中的炎癥因子IL-6、MCP-1和CRP水平，而且高劑量組降低更明顯，說明蝦青素對(duì)AS的ApoE-/-小鼠具有抗炎作用且有劑量依賴性。AS具有慢性炎癥反應(yīng)特征的病理過程，而且AS從粥樣硬化斑塊形成到斑塊破裂，以及血栓形成的各個(gè)階段都少不得炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的參與。IL-6由纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和T細(xì)胞等分泌，可通過誘導(dǎo)血小板源生長因子促進(jìn)血管平滑肌增殖，從而促進(jìn)AS的進(jìn)程。IL-6為調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能和代謝過程的細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的肩區(qū)表達(dá),通過刺激 MMP、MCP-1和TNF-α表達(dá)導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。在AS斑塊的CRP是反映感染和療效的指標(biāo)，水平高表明機(jī)體炎癥水平高。有研究表明，絕大部分心肌梗死患者CRP水平都很高。臨床已經(jīng)將CRP水平用于預(yù)測(cè)心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。單核細(xì)胞黏附于血管壁并進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞是AS早期病變。大量研究表明單核細(xì)胞趨化主要由MCP-1實(shí)現(xiàn)，臨床冠狀A(yù)S的MCP-1水平也增高[3]。

血小板不僅能促進(jìn)血栓形成，而且還是炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的重要關(guān)聯(lián)體。血小板可能激活炎癥反應(yīng)、釋放細(xì)胞因子，介導(dǎo)內(nèi)皮黏附以及相關(guān)脂蛋白的調(diào)節(jié)作用。研究表明高脂血癥患者的β-血小板球蛋白及血小板因子含量增加，血小板聚集性增強(qiáng)，表明高脂血癥患者的血小板活化加強(qiáng)[11]。體外實(shí)驗(yàn)證明，高脂血癥患者血小板比正常人血小板對(duì)促聚集劑更敏感。LDL-C能增加ADP誘導(dǎo)的纖維蛋白原與血小板的結(jié)合，其增強(qiáng)作用與LDL之間呈劑量依賴關(guān)系，通過這種增強(qiáng)作用，LDL能加快血小板的聚集，而oxLDL增加血小板聚集的作用更強(qiáng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素干預(yù)組血小板聚集明顯降低，這可能與蝦青素降低LDL和oxLDL有關(guān)系。