帕金森病模型細(xì)胞中p53、增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡①

李 季 郭繼東 張曉杰 楊 宏 李尊嚴(yán) 宋天琦 孫 微 馮 偉 李大偉

(北華大學(xué)第一臨床醫(yī)院，吉林 132011)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)變性疾病，其主要病理變化為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元逐漸變性凋亡,進(jìn)而遞質(zhì)失衡而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙為主的臨床癥狀[1]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)證明外源性及內(nèi)源性神經(jīng)毒素誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞變性凋亡在PD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，而氧化應(yīng)激在PD病理過(guò)程中起重要作用[2，3]。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)是誘發(fā)PD的常見(jiàn)環(huán)境毒素。MPTP通過(guò)血腦屏障后代謝生成毒性1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)，進(jìn)入線粒體抑制呼吸鏈進(jìn)而生成大量活性氧(reactive osygen species,ROS)，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞變性凋亡[4]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞變性凋亡的分子機(jī)制至今未完全闡明，但DNA氧化損傷在PD病理過(guò)程中具有重要作用[5]。

目前,體外培養(yǎng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元非常困難，因此可行的方案是以能大量增殖的類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞作為對(duì)象來(lái)探討MPP+細(xì)胞毒作用機(jī)制。PC12 細(xì)胞系是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，從大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分離得到，在形態(tài)、生理和生化功能等方面相似于正常神經(jīng)細(xì)胞,且具有中等水平的多巴胺β-羥化酶活性。誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型，模擬體內(nèi)自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，可作為多種神經(jīng)性疾病的體外細(xì)胞模型[6]。

本研究建立了MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞PD模型，探討p53、PCNA表達(dá)與細(xì)胞增殖、凋亡及病理變化特征,探索多巴胺能神經(jīng)元在氧化應(yīng)激病理?xiàng)l件下變性凋亡的分子機(jī)制，為PD治療提供新靶點(diǎn)及策略。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；胰蛋白酶購(gòu)于瑞士 LONZA 公司；MPP+、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體和p53抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司；辣根過(guò)氧化物酶包被抗小鼠二抗購(gòu)于美國(guó)Pierce公司；單鏈DNA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Chemicon Int公司。

1.1.2細(xì)胞株 PC12 細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó) Cellstar公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)于北京亞泰科隆公司；2S-1 型紫外線消毒車(chē)購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；液氮生物容器購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電熱恒溫水浴箱購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；4℃冰箱購(gòu)于中國(guó)西門(mén)子公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)于日本歐林帕斯公司；550 型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó) Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACSCantoⅡ。

1.2方法

1.2.1PC12細(xì)胞復(fù)蘇與傳代 從液氮罐中取出PC12細(xì)胞凍存管，常規(guī)消毒。無(wú)菌條件下稍松動(dòng)瓶蓋后擰緊，封口膜封閉，快速置于37℃水浴箱中搖動(dòng)融化。細(xì)胞解凍后取出凍存管,超凈臺(tái)中常規(guī)消毒后取出細(xì)胞懸液，經(jīng)離心處理后棄上清，重懸細(xì)胞并接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5%CO2、90%濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞增殖達(dá)80%左右匯合進(jìn)行傳代。棄培養(yǎng)液并用PBS清洗細(xì)胞，然后用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液在1 000 r/min、18℃的條件下離心5 min。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml接種傳代培養(yǎng)。傳至3代細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2MPTP誘發(fā)PC12損傷模型的建立 參考文獻(xiàn)[6]建立MPTP誘發(fā)PC12損傷模型。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞，調(diào)整至1×105個(gè)/ml，吸取0.2 ml 接種于96 孔板中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0(空白)、0.5、1、2 mmol/L 的MPP+的DMEM 培養(yǎng)基200 μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h，棄掉孔內(nèi)液體，每孔加入 150 μl DMSO 并輕輕振蕩以充分溶解甲臜顆粒，在酶標(biāo)儀 570 nm處測(cè)量各孔的吸光度(OD)值，觀察 MPP+對(duì) PC12 細(xì)胞的毒性損傷作用。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞，按損傷模型進(jìn)行分組，加入無(wú)胎牛血清稀釋的DCFH-DA(終濃度20 μmol/L)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)30 min。收集各組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀530 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)ROS。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) DNA氧化應(yīng)激損傷使用AO/EB凋亡染色進(jìn)行檢測(cè)。PC12細(xì)胞處理完成后加入熒光染料AO/EB，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。細(xì)胞核完整且被染成綠色的為存活細(xì)胞，核濃縮的為早期凋亡細(xì)胞，濃縮和碎裂且染成橘紅色的為晚期凋亡細(xì)胞。同時(shí)，采用酶聯(lián)免疫單鏈DNA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞DNA損傷，加入抗單鏈DNA單克隆抗體和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，在酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)各孔吸光值。

1.2.5Western blot檢測(cè)p53和PCNA表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞并裂解提取蛋白，測(cè)定濃度。參考文獻(xiàn)[6]方法，進(jìn)行各組蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜、洗膜。β-actin作為內(nèi)參。小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗滌，加入二抗室溫孵育2 h顯影。

2 結(jié)果

2.1不同濃度MPP+對(duì)細(xì)胞存活率影響 采用不同濃度MPP+(0、0.5、1、2 mmol/L)處理PC12細(xì)胞，反應(yīng)48 h后，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示細(xì)胞活力隨MPP+濃度增加而相應(yīng)減少，呈劑量依賴(lài)性，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2.2細(xì)胞ROS測(cè)定 MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生ROS，可以通過(guò)熒光染料DCFH-DA由流式細(xì)胞儀測(cè)定。DCFH-DA可通過(guò)細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)酯酶作用下生成DCFH。在細(xì)胞內(nèi)ROS作用下，DCFH生成具有較強(qiáng)熒光性的DCF。結(jié)果顯示隨著MPP+濃度增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.3A0/EB凋亡染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 單鏈DNA測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)隨著MPP+濃度增加，PC12細(xì)胞變性凋亡亦隨之增加，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖3、4。

圖1 不同濃度MPP+對(duì)PC12細(xì)胞存活率影響Fig.1 Effects of different concerntration of MPP+ on viability of PC12 cellsNote:Compared with control，*.P<0.05，**.P<0.01.

圖2 不同濃度MPP+對(duì)PC12細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響Fig.2 Effects of different concentration of MPP+ on ROS productionNote:Compared with control，**.P<0.01.

圖3 A0/EB染色觀察不同濃度MPP+對(duì)PC12細(xì)胞凋亡影響(×200)Fig.3 Effects of MPP+ on apoptosis of PC12 cells(×200)Note:Compared with control,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.4MPP+對(duì)PCNA和p53蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot檢測(cè)了PD細(xì)胞模型中PCNA和p53蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明當(dāng)使用1 mmol/L MPP+處理PC12細(xì)胞后，在12、24、48 h MTT測(cè)得的細(xì)胞活力分別為87%、77%、61%，而PCNA蛋白表達(dá)水平亦逐漸降低。隨著MPP+濃度增加，p53蛋白表達(dá)水平逐漸增加PCNA蛋白表達(dá)水平逐漸降低，見(jiàn)圖5、6。

圖4 不同濃度MPP+對(duì)PC12變性凋亡DNA變化的影響Fig.4 Effects of MPP+ on DNA fragments of apoptosis of PC12 cell linesNote:Compared with control，*.P<0.05，**.P<0.01.

圖6 不同濃度MPP+對(duì)p53和PCNA蛋白表達(dá)影響Fig.6 Effects of different concentration of MPP+ on expr-ession of p53 and PCNANote:Compared with control，*.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

PD臨床主要特征為肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少、震顫及姿勢(shì)步態(tài)異常，主要由中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡導(dǎo)致，其機(jī)制至今未明[7]。但更多證據(jù)表明，氧化應(yīng)激促發(fā)了一系列凋亡信號(hào)，參與了PD多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡過(guò)程[8]。多巴胺能神經(jīng)元因富含鐵和脂質(zhì)以及多巴胺自身代謝的原因，更易受氧化攻擊[9，10]。PD尸檢和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)DNA氧化損傷更易出現(xiàn)在中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，也證實(shí)了DNA氧化損傷是PD的重要病理機(jī)制[7]。DNA對(duì)細(xì)胞死亡和存活具有決定作用，因常遭受體內(nèi)外有害物質(zhì)攻擊，因此DNA修復(fù)對(duì)于保持完整性極為重要。本研究在PD細(xì)胞模型中顯示隨MPP+濃度增加，ROS生成增多，呈劑量依賴(lài)性，多巴胺能神經(jīng)元凋亡隨之增加，進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，以及氧化應(yīng)激參與PD病理過(guò)程，與國(guó)外報(bào)道一致[6,10]。

PCNA作為多功能蛋白，在染色體重組及DNA修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控中具有重要作用[8]。PCNA無(wú)內(nèi)在酶活性，可通過(guò)調(diào)節(jié)多種蛋白如周期蛋白依賴(lài)性激酶、周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子p21等發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。PCNA在DNA氧化損傷修復(fù)中亦有重要作用[9]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)隨MPP+濃度和劑量增加，PCNA蛋白表達(dá)呈劑量依賴(lài)性減少，支持此蛋白參與了MPP+對(duì)多巴胺能神經(jīng)元毒性損傷過(guò)程。另一方面，PCNA對(duì)維持DNA穩(wěn)定性，抵御各種致病因素包括氧化應(yīng)激對(duì)DNA的損傷具有重要作用，表達(dá)較少加重DNA在病理?xiàng)l件下?lián)p傷[10]。酶聯(lián)免疫單鏈DNA測(cè)定同樣證實(shí)了隨著MPP+濃度增加，DNA損傷逐漸加重。提示PCNA表達(dá)降低與DNA氧化損傷程度具有相關(guān)性。

轉(zhuǎn)錄因子p53調(diào)節(jié)一系列靶基因，參與細(xì)胞生物過(guò)程，包括細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[11]。在神經(jīng)組織，p53介導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過(guò)DNA損傷途徑實(shí)現(xiàn)。氧化應(yīng)激激活轉(zhuǎn)錄因子p53，引起DNA在氧化應(yīng)激狀態(tài)下?lián)p傷，其損傷機(jī)制在PD中未見(jiàn)報(bào)道。p53是PCNA上游信號(hào)蛋白，與特定序列結(jié)合后，調(diào)節(jié)此蛋白表達(dá)。高濃度野生型p53抑制PCNA啟動(dòng)子，減少PCNA蛋白生成[12]。在PD動(dòng)物模型中已證實(shí)p53高表達(dá)與多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡密切相關(guān)，p53抑制因子可有效阻止PD模型中多巴胺能神經(jīng)元在氧化應(yīng)激狀態(tài)下?lián)p傷[13]。本實(shí)驗(yàn)在PD細(xì)胞模型中，MPP+增加ROS生成和p53表達(dá)，證實(shí)氧化應(yīng)激激活p53使其高表達(dá)，及p53參與PD病理多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡過(guò)程，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14，15]。

本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了隨著MPP+增加PCNA表達(dá)減少，且與p53表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；隨著PCNA表達(dá)減少，DNA氧化損傷逐漸加重，多巴胺神經(jīng)元凋亡逐漸增加。這些實(shí)驗(yàn)提示在PD模型中，PCNA介導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是PD多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡分子機(jī)制之一，且ROS/p53/PCNA信號(hào)途徑參與這一過(guò)程。

通過(guò)PC12細(xì)胞建立的PD模型病理變化特征，我們推測(cè)MPP+介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元氧化損傷可能機(jī)制之一是通過(guò)p53/PCNA信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。氧化應(yīng)激激活p53，減少下游信號(hào)蛋白PCNA生成，加重DNA氧化損傷，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡。這一分子機(jī)制需進(jìn)一步證實(shí)，可為PD治療提供新分子靶點(diǎn)和策略。