硒提高雛雞抗MDV感染能力的試驗

文│康晨張家森（安徽省阜陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

馬立克氏病是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細胞浸潤和增大，引起肢（翅）麻痹，以及在性腺、虹膜、各種臟器、肌肉和皮膚上發(fā)生腫瘤病灶。病原為馬立克氏病毒（MDV），屬于皰疹病毒科禽皰疹病毒2型，是雞重要的傳染病病原，馬立克氏病也是目前危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的三大主要疫病（馬立克氏病、新城疫、雞傳染性法氏囊炎）之一。馬立克氏病在國內(nèi)呈散發(fā)流行。20世紀(jì)70年代在我國開始發(fā)現(xiàn)雞群感染馬立克氏病的病例，發(fā)病的雞群表現(xiàn)輕微的神經(jīng)癥狀和部分病雞發(fā)生內(nèi)臟型馬立克氏病。后來我國應(yīng)用火雞皰疹病毒疫苗，一定程度上控制了馬立克氏病疫情。近年來，由于出現(xiàn)馬立克氏病毒變異株，少數(shù)地區(qū)出現(xiàn)免疫失敗。一些野毒株甚至能在免疫過CVI988/Rispens株的雞群引發(fā)嚴(yán)重的疾病。它們的出現(xiàn)可能是一些地區(qū)雞群仍發(fā)生馬立克氏病的重要原因之一，不僅國外進口的肉雞、鵪鶉、山雞等禽類發(fā)病，我國本土品種雞也被發(fā)現(xiàn)感染馬立克氏病，經(jīng)火雞皰疹病毒（HVT）和馬立克氏病毒雙價苗免疫的雞群馬立克氏病發(fā)病率達1%～30%，神經(jīng)型死亡率1%～3%，內(nèi)臟型死亡率一般為25%～30%，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

微量元素硒是有機體生命活動必不可少的元素，在有機體的生長、發(fā)育、防止疾病的發(fā)生有著直接關(guān)系，尤其是與抗腫瘤方面有著密切關(guān)系。硒具有抗癌變、提高機體免疫力、清除體內(nèi)毒素、修復(fù)組織細胞、軟化血管、清理血管壁的膽固醇、改善血液循環(huán)通道、延緩衰老、預(yù)防多種疾病、降低患癌風(fēng)險等作用。同時，對重金屬引起的中毒還具有一定的保護和解毒作用，有抑制其吸收和促進排泄的作用。流行病學(xué)研究表明，血漿中硒含量過低易導(dǎo)致癌癥、心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。Karam等人研究發(fā)現(xiàn)，合成的有機硒化物比無機硒化物、天然硒化物具有更強的抗腫瘤活性和更低的毒性。

近年來，由于含硒藥物在抗腫瘤、抗病毒以及治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病等方面的應(yīng)用，已成為國內(nèi)外學(xué)者研發(fā)的熱點，藥物研究主要集中在抗腫瘤、抗炎和抗高血壓等方面。

超氧化物歧化酶（SOD）是一種具有特定生物催化功能的蛋白質(zhì)，由蛋白質(zhì)和金屬離子組成，廣泛存在于自然界的動植物以及一些微生物體內(nèi)。SOD活性的測定可以間接反映機體清除氧自由基的能力。丙二醛（MDA）作為脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物之一，被稱為生物體內(nèi)自由基的指示物，被廣泛作為各種氧自由基損傷機體的指標(biāo)。通過研究雛雞在飼料中添加亞硒酸鈉感染MDV后腎臟內(nèi)SOD活性和MDA含量，可以為硒在畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中的應(yīng)用以及在養(yǎng)雞業(yè)的科學(xué)飼養(yǎng)管理提供參考。

一、材料與方法

1.試劑和儀器。亞硒酸鈉化學(xué)純，含量為99%（上海金山縣興塔化工廠生產(chǎn)，批號：20130801），722分光光度計、水浴鍋、離心機、試管、燒杯、旋渦振蕩器、微量移液器等。

2.MDV的BJ-1株。

3.HVT疫苗。試驗用火雞皰疹病毒疫苗系美國Solvay公司生產(chǎn)，批號SerialNo.088/93。

4.M D A 測定試劑盒由南京建成生物研究所提供（批號：20140507）。

（1）操作方法。旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水?。ɑ蛴缅侀_蓋煮沸）40分鐘，取出后流水冷卻，然后4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清液，532納米處，1厘米光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。

（2）計算公式。血漿中MDA含量（納摩爾/毫升）=（測定管吸光度-測定空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10納摩爾/毫升）×樣本測試前稀釋倍數(shù)。

5.SOD試劑盒由南京建成生物研究所提供（批號：20130513）。

（1）操作方法。混勻，室溫放置10分鐘。在波長550納米處，1厘米光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。

（2）計算公式。血漿中SOD的含量＝（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×反應(yīng)的稀釋倍數(shù)×樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

6.試驗設(shè)計。150只商品羅曼雛雞在1日齡隨機分為3組，分別為對照組、攻毒組、攻毒加硒組（在基礎(chǔ)日糧中添加硒0.065毫克/千克）；攻毒組和攻毒加硒組雞群于第13天腹腔注射經(jīng)稀釋的BJ-1株血毒0.2毫升/只。分別從攻毒后7、14、28、56日齡的每組雞中隨機取5只雛雞，各取出1克腎臟樣品和生理鹽水按照1∶9放在研磨器中研磨，然后取上清液測定SOD的活性和MDA的含量。

表1蛋雞飼料配方

表2預(yù)混料成分及保證值（每千克含量）

7.試驗動物來源及管理。雛雞購于安徽吉鳳禽業(yè)有限公司，免疫雞群在1日齡時接種火雞皰疹病毒疫苗。攻毒組與非攻毒組雞在整個試驗期間分別隔離飼養(yǎng)于經(jīng)消毒的繁殖實驗室和動物房內(nèi)，予以同等的飼養(yǎng)管理，適時接種雞新城疫疫苗和雞傳染性法氏囊病疫苗。定期稱重，計算飼料消耗和料重比。飼養(yǎng)管理規(guī)范化，自由采食和飲水。日糧配方見表1、表2。

8.測定指標(biāo)與方法。血漿中SOD活性的測定嚴(yán)格按試劑盒說明書方法進行；血漿中MDA的含量測定嚴(yán)格按試劑盒說明書方法進行。

9.數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理測定結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示，用軟件對數(shù)據(jù)進行處理，確定差異顯著性。

二、結(jié)果

1.硒對雛雞感染MDV后腎臟中MDA含量的影響。從表3和圖1可知：7日齡攻毒組腎臟中MDA的含量高于對照組肝臟中MDA的含量（P＞0.05），但未達到顯著水平。攻毒加硒組腎臟中MDA的含量低于攻毒組和對照組腎臟中MDA的含量（P＞0.05），但未達到顯著水平；14日齡攻毒組腎臟中MDA的含量顯著地高于對照組腎臟中MDA含量（P＜0.05），攻毒加硒組肝臟中MDA的含量低于攻毒組中MDA的含量（P＞0.05），但未達到顯著水平；28日齡攻毒組腎臟中MDA的含量顯著高于對照組腎臟中MDA的含量（P＜0.05），攻毒加硒組腎臟中MDA的含量極顯著低于攻毒組腎臟中MDA的含量（P＜0.01），低于對照組腎臟中MDA的含量（P＞0.05）；56日齡攻毒組腎臟中MDA含量高于對照組腎臟中MDA含量（P＞0.05），但未達到顯著水平。攻毒加硒組腎臟中MDA的含量低于攻毒組和對照組腎臟中MDA的含量（P＞0.05），但未達到顯著水平。試驗結(jié)果表明，日糧中添加硒元素在28日齡雞只時可以有效地降低腎臟中MDA的含量，即使是感染MDV后的雞群；7日齡、14日齡以及56日齡腎臟中MDA的含量與對照組相比有降低的趨勢，但未達到顯著水平（P＞0.05）。

◎圖1雛雞感染MDV后腎臟中MDA含量變化柱形圖

◎圖2雛雞感染MDV后腎臟中SOD活性變化的柱形圖

2.硒對雛雞感染MDV后腎臟中SOD活性的影響。從表4和圖2可知：7日齡攻毒組腎臟中SOD的活性極顯著地低于對照組腎臟中SOD的活性（P＜0.01），攻毒加硒組腎臟中SOD活性高于攻毒組腎臟中SOD的活性（P＞0.01），但未達到顯著水平；28日齡各組間腎臟中SOD的活性差異均未達到顯著水平（P＞0.05）；56日齡攻毒組腎臟中SOD的活性與對照組腎臟中SOD的含量差異不顯著（P＞0.05），攻毒硒組腎臟中SOD的活性高于攻毒硒組腎臟中S O D 的活性，但未達到顯著水平（P＞0.05）。試驗結(jié)果表明，日糧中添加硒元素在7日齡相比攻毒組可以極顯著地增強SOD的活性（P＜0.01）；28日齡和56日齡雛雞腎臟中SOD的活性與對照組和攻毒組相比有增強的趨勢，但均未達到顯著水平（P＞0.05）。

三、討論

1.硒對雛雞感染MDV后腎臟中MDA含量的影響。MDA是機體內(nèi)氧自由基代謝中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，它可以反映該體系中脂質(zhì)過氧化自由基的存在及細胞膜過氧化的程度。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷。因而測定MDA的含量常?？煞磻?yīng)機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。由表3和圖1知，攻毒組MDA的含量始終都高于對照組，說明MDV能

表3雛雞感染MDV后腎臟中MDA含量的變化（Mean±SE，n=5，納摩爾/毫升）

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表4雛雞感染MDV后腎臟中SOD活性的動態(tài)變化（Mean±SE，n＝5，U/毫升）夠作用于機體產(chǎn)生更多的MDA，增加其對機體的損害程度。尤其在雛雞早期這種損害效果更明顯，隨著雞群日齡的增加，MDV對提高雞群體內(nèi)的MDA的含量越來越不明顯。而攻毒硒組的MDA含量總體小于攻毒組和對照組，說明在日糧中添加硒可以減少MDV對雞體的損害，尤其在28日齡之前。本實驗結(jié)果表明：日糧中添加硒元素使體內(nèi)硒含量增多，能增加過氧化物酶的活性，提高抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基，使MDA含量下降，從而減少有害物質(zhì)對機體的損害，提高抵抗MDV的能力。

2.硒對感染MDV的雛雞腎臟中SOD活性的影響。在生物的進化系統(tǒng)中，細胞內(nèi)形成了防御活性氧毒害的保護機制，其中起重要作用的是SOD，其主要功能是清除氧氣而產(chǎn)生過氧化氫和氧氣，但過氧化氫可以和氧氣相互作用產(chǎn)生更多的自由基，凡是能提高機體內(nèi)抗氧化酶活性的物質(zhì)同時也具有了抑制及清除自由基的作用，自由基清除劑能清除自由基對機體的毒害作用。由表4和圖2知，7日齡、28日齡、56日齡攻毒加硒組腎臟中SOD活性高于攻毒組的活性，說明在日糧中添加硒能夠提高感染MDV雛雞腎臟中SOD的活性。本實驗研究結(jié)果表明：日糧中添加硒元素，會使體內(nèi)硒含量增加并能增加過氧化物酶的活性，提高抗氧化能力，從而增強雛雞的免疫力，提高雛雞抗MDV感染的能力。